多形红斑与HLA相关性研究
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作者：姜海燕 宋芳吉 翟宁 肖毅
单位：宋芳吉 翟宁 肖毅(110001沈阳，中国医科大学第一临床医院皮肤科)；姜海燕(现在沈阳市第七人民医院皮肤科)
关键词：红斑；多形；HLA抗原；聚合酶链反应
中华皮肤科杂志000512
【摘要】目的研究多形红斑与HLA相关性。方法采用血清学技术和聚合酶链式反应-序列特异性引物技术,检测多形红斑患者HLAⅠ类抗原和HLAⅡ类基因。结果在30例多形红斑患者中,HLA-A30+31、B13抗原频率较对照组明显增高(A30+31：Pc<0.01,RR=6.64;B13：Pc<10-3,RR=7.88)。HLA-DQB1*04基因频率在多形红斑患者较正常人对照组明显增高(DQB1*04：Pc<10-3,RR=4.8125),而HLA-DQB1*03基因频率较正常人对照组明显降低(DQB1*03:Pc<10-5,RR=0.07)。结论多形红斑与HLA-A30+31、B13、DQB1*04呈正相关,与HLA-DQB1*03呈负相关。
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Study on the Association Between HLA and Erythema Multiforme
JIANG Haiyan，SONG Fangji，ZHAI Ning，et al.
(Department of Dermatology, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001)
【Abstract】Objective To investigate the association of erythema multiforme(EM) with HLA. Methods ClassⅠ HLA antigen was detected by serology and classⅡ HLA gene typing was performed by PCR- SSP method, thirty patients with EM were detected. Results The frequency of HLA- A30+ 31 and HLA- B13 antigen was significantly higher in EM patients than that in the controls(A30+ 31:Pc<0.01,RR=6.64;B13:Pc< 10- 3,RR=7.88).The frequency of HLA- DQB1* 04 gene was markedly higher in patients than that in the controls (DQB1* 04: Pc< 10- 3,RR=4.8125),while the frequency of DQB1* 03 gene was significantly lower in EM patients than that in the controls(DQB1* 03:Pc< 10- 5,RR=0.07). Conclusion There is a positive correlation between EM and HLA- A30+ 31、 B13、 DQB1* 04,with a negative correlation between EM and HLA- DQB1* 03.
, 百拇医药
【Key words】 Erythema， multiforme HLA antigens Polymerase chain reaction
自1967年Amiel开创了HLA与疾病的相关性研究以来[1],目前已报道有100多种疾病与各种HLA抗原有关。为探索多形红斑发病机理中免疫遗传因素的作用,我们进行了多形红斑与HLA相关性的研究。现将结果报道如下。
材料和方法
1.研究对象:病例组:30例经门诊诊断的多形红斑患者,均为汉族,彼此间无血缘关系。男12例,女18例,年龄11～70岁。所有多形红斑患者排除药物因素,而且具有靶形红斑。单纯疱疹病毒引起者1例,细菌引起者5例,特发性多形红斑16例,复发性多形红斑8例。30例多形红斑患者同时检测了Ⅰ类抗原、Ⅱ类基因。对照组:Ⅰ类抗原:选择无血缘关系的汉族健康人100例,年龄15～58岁。男57例,女43例。Ⅱ类基因:选择无血缘关系的汉族健康人104例,年龄17～50岁。男50例,女54例。
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2.实验方法:Ⅰ类抗原的检测:采用国际通用的NIH标准微量淋巴细胞毒试验方法[2,3]:外周血淋巴细胞分离。HLA-AB血清板每孔加1μL淋巴细胞悬液,22℃～24℃孵育30min。每孔加5%伊红染色5min后用37%中性甲醛固定。室温下静置60min后,在倒置显微镜下读数。本实验所用HLA-AB血清板由上海市血液中心HLA血清库提供。HLA-A位点包括HLA-A1、A2、A3、A9、A10、A11、A28、A29、A30、A30+31、A3311个特异性,HLA-B位点包括HLA-B5、B51(5)、B7、B8、B12、B13、B15、B16、B17、B57(17)、B22、B27、B35、B39、B40、B44、B46共17个特异性。Ⅱ类基因的检测:采用聚合酶链式反应-序列特异性引物技术(PCR-SSP)。快速盐析法提取DNA。PCR反应体系为25μL体积中含有模板DNA100ng、10×缓冲液2.5μL、2.5mmol/LdNTP2.5μL、25mmol/LMgCl21.5μL。双蒸水滴加至25μL。每条引物0.25μmol/L。循环参数：94℃预变性4min后,94℃1min,65℃1min,72℃1min,计35个循环,后延伸72℃2min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察结果并照相。本实验所用22种引物由美国Florida大学提供。引物内部指控带为400bp,我们所检测的基因都在300bp以下。内部指控带除作为标准参照物外,尚有质量控制作用,体现各反应体系浓度是否正常。Taq酶、dNTP、10×缓冲液由Promega公司生产。
, 百拇医药
表1 多形红斑患者与正常人HLA-A，B基因频率比较(P<0.05者)
HLA基因
正常人组(n=100)
患者组(n=30)
χ2值
P值
Pc值
RR
阳性例数
抗原频率
基因频率
阳性例数
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抗原频率
基因频率
A1
4
0.04
0.0202
5
0.17
0.0890
3.95
<0.05
>0.05
4.80
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A30+31
7
0.07
0.0356
10
0.33
0.1815
11.86
<10-3
<0.01
6.64
B13
10
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0.10
0.0050
14
0.47
0.2720
18.23
<10-4
<10-3
7.88
B17
9
0.09
0.0461
, 百拇医药
8
0.27
0.1456
4.87
<0.05
>0.05
3.68
表2 多形红斑患者与正常人HLA-DR、DQ基因频率比较(P<0.05者)
HLA基因
正常人组(n=104)
患者组(n=30)
χ2值
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P值
Pc值
RR
阳性例数
基因频率
阳性例数
基因频率
DQB1*03
77
0.4905
5
0.0871
29.19
, 百拇医药
<10-6
<10-5
0.07
DQB1*04
16
0.0801
14
0.2697
11.37
<10-4
<10-3
4.81
3.统计学处理方法：HLA与疾病相关的统计学计算采用Yata法计算校正χ2值,相对危险度(RR),用Fisher法计算确切P值,校正P值Pc为将所得P值乘以这个位点抗原数[3,4]。
, 百拇医药
结果
多形红斑患者与正常人对照组HLA-A、B位点抗原频率、基因频率比较(P<0.05者)见表1。从表1见到多形红斑患者组HLA-A1、A30+31、B13、B17抗原频率明显高于对照组，经校正P值后HLA-A30+31、B13差异仍有显著性(A30+31:Pc<0.01;B13：Pc<10-3)。多形红斑患者组与正常对照组HLA-DR、DQ位点基因频率比较(P<0.05者)见表2。由表2见到多形红斑患者组HLA-DQB1*04基因频率明显高于对照组，HLA-DQB1*03基因频明显低于对照组，经校正P值后差异仍有显著性(DQB1*03:Pc<10-5,DQB1*04:Pc<10-3)。
讨论
1983年Duvic等[5]报道多形红斑与HLA-B15相关。1988年Kampgen等[6]报道单纯疱疹诱导的多形红斑与DQW3相关。同年Lepage等[7]报道多形红斑与HLA-A33和DR53相关。1991年Khalil等[8]报道多形红斑与HLA-DQB1*0301相关，但该文35例患者中有17例是单纯疱疹诱导的多形红斑。1994年Schofield等[9]证实多形红斑与B15、B35、Cw4和DR52相关。1998年Malo等[10]报道复发性单纯疱疹诱导的多形红斑与HLA-DQB1*0302相关。我们对30例多形红斑患者进行HLA-A、B位点抗原分析,结果多形红斑与HLA-A30+31、B13明显相关,即具有HLA-A30+31、B13抗原者患多形红斑的可能性大。由于A30+31与A33均为A19的裂解产物,因此本实验结果与Lepage等报道基本类似。我们同时对30例多形红斑患者进行了HLAⅡ类基因的检测,发现多形红斑患者HLA-DQB1*04基因频率显著增高,而DQB1*03基因频率显著降低。即具有HLA-DQB1*04基因者患多形红斑可能性大,而具有HLA-DQB1*03基因者患多形红斑可能性小。DQB1*03为中国人较常见的HLA基因型，正常人群中频率为49.0%,在多形红斑患者中仅为8.7%；DQB1*04为中国人较少见的HLA基因型，正常人群中频率为8.0%，多形红斑患者中却为27.0%。HLAⅡ类基因检测结果与文献报道不完全一致,我们认为这种差异可能是由于病例选择、人种不同所致。
, 百拇医药
参考文献
[1]Ozawa A,Ohkidom,Tsuji K. Some recent advances in HLA and skin disease. J Am Acad Dermatol, 1981,4:205- 230.
[2]宋芳吉,李惠刚. HLA分型方法及其临床意义. 生理科学，1988,8:204.
[3]Tiwari JL,Terasaki PI. HLA and disease association.New York : Sping- Verlag, 1985.4- 26.
[4] Rose NR,Demacario EC,Fahey JK,et al. Mannual of clinical laboratory immunology,4th ed.Washinton: American Society for Microbiology, 1992.867- 876.
, 百拇医药
[5]Duvic M ,Reisner EG,Dawson DV,et al. HLA- B15 association with erythema multiforme. J Am Acad Dermatol, 1983,8:493- 496.
[6]Kampgen E,Burg G,Wank R. Association of herpes simplex virus induced erythema multiforme with the human leukocyte antigen DQw3. Arch Dermatol, 1988,124:1372- 5375.
[7]Lepage V, Douay C, Mank R, et al. Erythema multiforme is associated to HLA- A33和 DR53. Tissue Antigens, 1988,32:170- 175.
, 百拇医药
[8]Khalil I, Lepage V, Douay C,et al. HLA- DQB1* 0301 allele is involved in the susceptibility to erythema multiforme. J Invest Dermatol, 1991,97:697- 700.
[9]Schofield JK, Tatnall FM,Brown J, et al. Recurrent erythema multiforme;tissue typing in a large series of patients. Br J Dermatol, 1994,131: 532- 535.
[10]Malo A, Kampgen E, Wank R Recurrent herpes simplex virus- induced erythema multiforme: different HLA- DQB1 alleles associate with severe mucous membrane versus skin attacks. Scand J Immunol, 1998,47:408- 411.
(收稿日期：1999-12-22), 百拇医药
单位：宋芳吉 翟宁 肖毅(110001沈阳，中国医科大学第一临床医院皮肤科)；姜海燕(现在沈阳市第七人民医院皮肤科)
关键词：红斑；多形；HLA抗原；聚合酶链反应
中华皮肤科杂志000512
【摘要】目的研究多形红斑与HLA相关性。方法采用血清学技术和聚合酶链式反应-序列特异性引物技术,检测多形红斑患者HLAⅠ类抗原和HLAⅡ类基因。结果在30例多形红斑患者中,HLA-A30+31、B13抗原频率较对照组明显增高(A30+31：Pc<0.01,RR=6.64;B13：Pc<10-3,RR=7.88)。HLA-DQB1*04基因频率在多形红斑患者较正常人对照组明显增高(DQB1*04：Pc<10-3,RR=4.8125),而HLA-DQB1*03基因频率较正常人对照组明显降低(DQB1*03:Pc<10-5,RR=0.07)。结论多形红斑与HLA-A30+31、B13、DQB1*04呈正相关,与HLA-DQB1*03呈负相关。
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Study on the Association Between HLA and Erythema Multiforme
JIANG Haiyan，SONG Fangji，ZHAI Ning，et al.
(Department of Dermatology, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001)
【Abstract】Objective To investigate the association of erythema multiforme(EM) with HLA. Methods ClassⅠ HLA antigen was detected by serology and classⅡ HLA gene typing was performed by PCR- SSP method, thirty patients with EM were detected. Results The frequency of HLA- A30+ 31 and HLA- B13 antigen was significantly higher in EM patients than that in the controls(A30+ 31:Pc<0.01,RR=6.64;B13:Pc< 10- 3,RR=7.88).The frequency of HLA- DQB1* 04 gene was markedly higher in patients than that in the controls (DQB1* 04: Pc< 10- 3,RR=4.8125),while the frequency of DQB1* 03 gene was significantly lower in EM patients than that in the controls(DQB1* 03:Pc< 10- 5,RR=0.07). Conclusion There is a positive correlation between EM and HLA- A30+ 31、 B13、 DQB1* 04,with a negative correlation between EM and HLA- DQB1* 03.
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【Key words】 Erythema， multiforme HLA antigens Polymerase chain reaction
自1967年Amiel开创了HLA与疾病的相关性研究以来[1],目前已报道有100多种疾病与各种HLA抗原有关。为探索多形红斑发病机理中免疫遗传因素的作用,我们进行了多形红斑与HLA相关性的研究。现将结果报道如下。
材料和方法
1.研究对象:病例组:30例经门诊诊断的多形红斑患者,均为汉族,彼此间无血缘关系。男12例,女18例,年龄11～70岁。所有多形红斑患者排除药物因素,而且具有靶形红斑。单纯疱疹病毒引起者1例,细菌引起者5例,特发性多形红斑16例,复发性多形红斑8例。30例多形红斑患者同时检测了Ⅰ类抗原、Ⅱ类基因。对照组:Ⅰ类抗原:选择无血缘关系的汉族健康人100例,年龄15～58岁。男57例,女43例。Ⅱ类基因:选择无血缘关系的汉族健康人104例,年龄17～50岁。男50例,女54例。
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2.实验方法:Ⅰ类抗原的检测:采用国际通用的NIH标准微量淋巴细胞毒试验方法[2,3]:外周血淋巴细胞分离。HLA-AB血清板每孔加1μL淋巴细胞悬液,22℃～24℃孵育30min。每孔加5%伊红染色5min后用37%中性甲醛固定。室温下静置60min后,在倒置显微镜下读数。本实验所用HLA-AB血清板由上海市血液中心HLA血清库提供。HLA-A位点包括HLA-A1、A2、A3、A9、A10、A11、A28、A29、A30、A30+31、A3311个特异性,HLA-B位点包括HLA-B5、B51(5)、B7、B8、B12、B13、B15、B16、B17、B57(17)、B22、B27、B35、B39、B40、B44、B46共17个特异性。Ⅱ类基因的检测:采用聚合酶链式反应-序列特异性引物技术(PCR-SSP)。快速盐析法提取DNA。PCR反应体系为25μL体积中含有模板DNA100ng、10×缓冲液2.5μL、2.5mmol/LdNTP2.5μL、25mmol/LMgCl21.5μL。双蒸水滴加至25μL。每条引物0.25μmol/L。循环参数：94℃预变性4min后,94℃1min,65℃1min,72℃1min,计35个循环,后延伸72℃2min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察结果并照相。本实验所用22种引物由美国Florida大学提供。引物内部指控带为400bp,我们所检测的基因都在300bp以下。内部指控带除作为标准参照物外,尚有质量控制作用,体现各反应体系浓度是否正常。Taq酶、dNTP、10×缓冲液由Promega公司生产。
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表1 多形红斑患者与正常人HLA-A，B基因频率比较(P<0.05者)
HLA基因
正常人组(n=100)
患者组(n=30)
χ2值
P值
Pc值
RR
阳性例数
抗原频率
基因频率
阳性例数
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抗原频率
基因频率
A1
4
0.04
0.0202
5
0.17
0.0890
3.95
<0.05
>0.05
4.80
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A30+31
7
0.07
0.0356
10
0.33
0.1815
11.86
<10-3
<0.01
6.64
B13
10
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0.10
0.0050
14
0.47
0.2720
18.23
<10-4
<10-3
7.88
B17
9
0.09
0.0461
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8
0.27
0.1456
4.87
<0.05
>0.05
3.68
表2 多形红斑患者与正常人HLA-DR、DQ基因频率比较(P<0.05者)
HLA基因
正常人组(n=104)
患者组(n=30)
χ2值
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P值
Pc值
RR
阳性例数
基因频率
阳性例数
基因频率
DQB1*03
77
0.4905
5
0.0871
29.19
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<10-6
<10-5
0.07
DQB1*04
16
0.0801
14
0.2697
11.37
<10-4
<10-3
4.81
3.统计学处理方法：HLA与疾病相关的统计学计算采用Yata法计算校正χ2值,相对危险度(RR),用Fisher法计算确切P值,校正P值Pc为将所得P值乘以这个位点抗原数[3,4]。
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结果
多形红斑患者与正常人对照组HLA-A、B位点抗原频率、基因频率比较(P<0.05者)见表1。从表1见到多形红斑患者组HLA-A1、A30+31、B13、B17抗原频率明显高于对照组，经校正P值后HLA-A30+31、B13差异仍有显著性(A30+31:Pc<0.01;B13：Pc<10-3)。多形红斑患者组与正常对照组HLA-DR、DQ位点基因频率比较(P<0.05者)见表2。由表2见到多形红斑患者组HLA-DQB1*04基因频率明显高于对照组，HLA-DQB1*03基因频明显低于对照组，经校正P值后差异仍有显著性(DQB1*03:Pc<10-5,DQB1*04:Pc<10-3)。
讨论
1983年Duvic等[5]报道多形红斑与HLA-B15相关。1988年Kampgen等[6]报道单纯疱疹诱导的多形红斑与DQW3相关。同年Lepage等[7]报道多形红斑与HLA-A33和DR53相关。1991年Khalil等[8]报道多形红斑与HLA-DQB1*0301相关，但该文35例患者中有17例是单纯疱疹诱导的多形红斑。1994年Schofield等[9]证实多形红斑与B15、B35、Cw4和DR52相关。1998年Malo等[10]报道复发性单纯疱疹诱导的多形红斑与HLA-DQB1*0302相关。我们对30例多形红斑患者进行HLA-A、B位点抗原分析,结果多形红斑与HLA-A30+31、B13明显相关,即具有HLA-A30+31、B13抗原者患多形红斑的可能性大。由于A30+31与A33均为A19的裂解产物,因此本实验结果与Lepage等报道基本类似。我们同时对30例多形红斑患者进行了HLAⅡ类基因的检测,发现多形红斑患者HLA-DQB1*04基因频率显著增高,而DQB1*03基因频率显著降低。即具有HLA-DQB1*04基因者患多形红斑可能性大,而具有HLA-DQB1*03基因者患多形红斑可能性小。DQB1*03为中国人较常见的HLA基因型，正常人群中频率为49.0%,在多形红斑患者中仅为8.7%；DQB1*04为中国人较少见的HLA基因型，正常人群中频率为8.0%，多形红斑患者中却为27.0%。HLAⅡ类基因检测结果与文献报道不完全一致,我们认为这种差异可能是由于病例选择、人种不同所致。
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参考文献
[1]Ozawa A,Ohkidom,Tsuji K. Some recent advances in HLA and skin disease. J Am Acad Dermatol, 1981,4:205- 230.
[2]宋芳吉,李惠刚. HLA分型方法及其临床意义. 生理科学，1988,8:204.
[3]Tiwari JL,Terasaki PI. HLA and disease association.New York : Sping- Verlag, 1985.4- 26.
[4] Rose NR,Demacario EC,Fahey JK,et al. Mannual of clinical laboratory immunology,4th ed.Washinton: American Society for Microbiology, 1992.867- 876.
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[5]Duvic M ,Reisner EG,Dawson DV,et al. HLA- B15 association with erythema multiforme. J Am Acad Dermatol, 1983,8:493- 496.
[6]Kampgen E,Burg G,Wank R. Association of herpes simplex virus induced erythema multiforme with the human leukocyte antigen DQw3. Arch Dermatol, 1988,124:1372- 5375.
[7]Lepage V, Douay C, Mank R, et al. Erythema multiforme is associated to HLA- A33和 DR53. Tissue Antigens, 1988,32:170- 175.
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[8]Khalil I, Lepage V, Douay C,et al. HLA- DQB1* 0301 allele is involved in the susceptibility to erythema multiforme. J Invest Dermatol, 1991,97:697- 700.
[9]Schofield JK, Tatnall FM,Brown J, et al. Recurrent erythema multiforme;tissue typing in a large series of patients. Br J Dermatol, 1994,131: 532- 535.
[10]Malo A, Kampgen E, Wank R Recurrent herpes simplex virus- induced erythema multiforme: different HLA- DQB1 alleles associate with severe mucous membrane versus skin attacks. Scand J Immunol, 1998,47:408- 411.
(收稿日期：1999-12-22), 百拇医药