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编号:10291413
补肾活血胶囊影响兔膝关节退变性疾病组织形态学的实验研究
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     作者:王羽丰 许学猛 邓晋丰

    单位:广州中医药大学 第二附属医院骨科 广东 广州 510120

    关键词:膝;骨关节炎;中医药疗法;组织形态学;实验研究;动物;模型

    中国中医骨伤科990403 摘要 为观察补肾活血中药对膝DOA的治疗作用,将45只新西兰纯种大白兔,通过结扎左股静脉和臀下静脉及将结扎肢伸直位固定造成膝DOA模型,对侧仅切开皮肤后缝合(假性手术)为对照侧。术后随机分为三组,A组(空白对照组):术后每天喂以普通饲料,于术后4、6、8W分批抽样进行观察;B组(试验预防组):术后1W开始每天喂等量混有药物的混合饲料,抽样观察时间同B组;C组(试验治疗组):术后6W开始给药,方法同B组,于术后8、10、12W抽样观察。观察方式:先行肉眼观察关节病变、然后处死行病检切片光镜观察。结果:术后4W,B组平均病损积分略低于A组,但差距不大;6W、8W后,B组平均病损积分明显低于A组;而C组,术后8、10、12W病损积分改变不大,但关节炎性病变明显减轻。说明补肾活血方药具有预防实验性家兔膝DOA的作用,能减轻或延缓关节软骨退变的发生和发展,对己有明显退变的关节软骨难以修复,但可减缓其病变进一步加重。
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    中图分类法:R684.3 文献标识码:A 文章编号 1005-0205(1999)04-0009-04

    An Experimental Study on change of Histomorphology of Degenerative Osteoarthritis of

    Rabbit Knee Joint with Tonify-kidney and Activate-blood Capsule


    Wang Yufeng, Xu Xuemeng,Deng Jinfeng

    Orthopaedic Department of the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM
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    ABSTRACT In order to observe the therapy effect of Tonify-kidney and activate-blood formulae(TKABF) on degenerative osteoarthritis (DOA) of knee joint.45 rabbits' left knee DOA models were established through knotting left femoral vein and inferior gluteal vein and fixing the left lower limbs in extension position,the right lower limbs were control limbs,which were only cut out the skin(Sham operation).After operation the rabbits were allocated into three groups at random.Group A (control group):fed with normal forage each day after operation,observation of histomorphology was taken respectively at the time of 4、6、8w after operation.Group B(experimental preventing group):fed forage mixed with herb,observation method was the same as Group B;Group C(experimental treating group):the method of giving herb was the same as Group B,observation was taken at the time of 8,10,12W after operation.Results:After operation 4W,the mean lesion score of Group B was mildly lower than Group A's,but the difference was small.After 6,8W,the mean lesion score of Group B was significantly lower than Group A's.Group C:After 8,10,12W,the mean score changed a little,but the inflammation of joint was apparently relieved.The result demonstrated TDABF had action of preventing experimental rabbit knee DOA,relieving or slowing the cartilage degeneration.It's difficult to repair the apparently degenerative articular cartilage,but can prevent the damage from getting worse.
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    KEY WORDS Osteoarthritis Chinese medical therapy Histomorphology Animal model Experimental study

    退行性膝关节病(Degenerative Osteoarthritis,简称DOA),又称膝骨关节炎(Osteoarthritis,简称OA),是由于膝关节及其周围软组织的退变,关节软骨面变性,断裂甚至脱落,软骨下骨质增生、硬化、关节边缘骨刺形成,继发滑膜和关节炎性充血、肥厚、增生,上述原因产生一系列的临床症状,统称为退行性膝关节病,其临床症状主要为膝部疼痛,功能受限等。本病病变部位在关节软骨与骨质部分,药物的治疗主要是恢复软骨与骨质的正常分布与功能。[1]西药中主要用非激素类药物起到消炎止痛作用,但一般只对急性发作期有些效果,关节腔内注射可的松虽可减轻症状,但有使关节破坏发展的可能,不宜长期多次使用。[2]而全国第二批伤科带徒名中医邓晋丰教授善于采用补肾活血法治疗膝DOA并取得良好效果,特别在减轻关节疼痛、消除肿胀、改善关节功能方面有较好的疗效。但至今为止,补肾活血方药减轻膝DOA症状的作用和机理尚未明了,本实验拟从组织形态学的改变来观察中药对实验性DOA的治疗作用,并探讨其作用机理,为临床研究中药防治膝DOA提供实验依据。
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    材料和方法

    1 动物选择 新西兰纯种大白兔(中老年)54只,雌雄各半,每只体重约2.5~3.0kg。

    2 造模 3%戊巴比妥钠溶液按体重30mg/kg的剂量作兔耳缘静脉推注麻醉后,将兔仰卧固定于手术台上,双髋关节外展稍屈曲,双膝关节屈曲30度,于左腹股沟处作1cm纵切口,分离出股静脉,紧靠腹股沟韧带处作双重结扎,再于左臀部髋关节后外侧做小切口,分离出髂内静脉的属支臀下静脉,行双重结扎,缝合皮下各层和皮肤。右下肢于相同部位仅切开皮肤,暴露出静脉,不结扎,再缝合行假性对照。术后立即以矫形绷带打管形石膏固定左膝于伸直位,所有兔子单笼饲养,于笼中自由活动。

    3 动物分组与施加因素 54只家兔中,因麻醉意外死亡、感染及造模不当等原因被剔除9只,剩余45只按雌雄体重均衡后,分成A、B、C三组,每组15只。
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    A组(空白对照组):每天以普通饲料喂养,术后4、6、8W各抽样5只进行观察。

    B组(试验预防组):术后1W开始每天喂以等量混合饲料(经加工浓缩中药制剂与普通饲料均匀混合,制成颗粒状饲料),按0.9g/kg/日投药,观察方式同A组。

    C组(试验治疗组):于术后6W开始投药,方法同B组,分别于术后8、10、12W各抽样5只观察。

    4 观察方式 每只家兔要先测双膝旁骨内压和膝内压(结果见另文),后空气栓塞处死,打开双膝关节腔,肉眼观察病变并记录,取下双膝关节面,标本用l%的福尔马林固定(包含1%醋酸与7%EDTA),脱钙、石腊包埋后,切片。切片部位:胫骨平台标本取前外象限的1/2的交界处,股骨髁标本取外髁之中央点处,此处应力最大。苏木素和伊红染色观察形态学,嗜番红染色观察蛋白多糖着色,光镜观察并记录之。观察指标参照C.Colombo的标准,[3]进行积分统计,见表1。
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    表1 胫股关节软骨指标及评分标准 关节软骨损害

    积 分

    +1

    +2

    +3

    +4

    表层缺损

    轻微

    中等

    较严重

    十分严重

    溃 疡

    可看到
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    中等

    较严重

    十分严重

    表面脆裂

    可看到

    中等

    明显

    十分严重

    (原纤维形成)

    裂 纹

    1个十分小的

    1个小的

    2个小的或
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    1个中等

    3个小,2个中

    等或1个大的

    假性囊肿

    1个十分小的

    1个小的

    2个小的或

    1个大的

    3个小的或

    2个大的

    骨赘形成

    十分小

    小
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    中等

    大

    可染蛋白

    染色比对照组

    嗜番红染色中

    嗜番红染色明

    嗜番红染色基

    多糖缺失

    苍白

    度缺失

    显缺失

    本上缺失

    软骨细胞紊乱
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    可观察到

    中等,细胞支柱

    有些缺失

    明显细胞框架

    缺失

    结构不可分辨

    软骨细胞缺失

    可观察细胞减少

    细胞中等度减少

    细胞明显减少

    细胞严重减少

    软骨下骨

    的裸露
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    较小外露

    中等外露

    较严重外露

    十分严重裸露

    结果

    A组:术后4W左膝关节有少许炎性变,关节液透明稍浅黄,滑膜稍肿轻度充血、半月板正常,软骨表面有轻微表层缺损,基本未见到明显溃疡面和软骨下骨裸露,于胫股骨髁外侧和中央可见十分小的骨赘,可染蛋白多糖染色比对照组苍白,软骨细胞稍减少。术后6W关节液呈浅黄色稍混浊,滑膜肿胀,较明显充血,软骨表面中等表层缺损,可见到多个小骨赘和溃疡面及轻度软骨下骨裸露,氨基多糖染色中度缺失,软骨细胞中度减少。8W后,病理变化较6W均有不同程度加重,可见关节液混浊,滑膜明显肿胀充血肥厚,明显表层缺损和较大的溃疡面及软骨下骨裸露,偶见到半月板有缺损和假性囊肿。B组:术后4W左膝关节有轻微炎性变,软骨退变程度十分轻,6W时各项病理变化明显轻于A组,可见到轻微关节软骨表层缺损,较小的溃疡面,偶有软骨下骨裸露,氨基多糖染色变浅,软骨细胞轻度减少等,8W后病理变化与6W后相似,病变稍有加重。C组8W后病理变化与A组8W后病变相似,10W、12W后,C组软骨面缺损、溃疡面、骨赘的形成及软骨下骨裸露,软骨细胞的缺失等无明显改善,但关节滑膜充血,肿胀明显减轻,关节液多显半透明浅黄色。所有家兔的假手术侧膝关节未见到明显病理变化,各组膝关节造模侧病损程度积分比较见表2。
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    表2 术后各周家兔左膝胫股骨髁病损积分 术后

    周数

    样本

    数

    A组

    B组

    C组

    F

    T

    F

    T

    F

    T
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    4W

    5

    8.4

    11.8

    6.2

    8.2

    0

    0

    6W

    5

    16.4

    20

    9.8

    13.2
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    0

    0

    8W

    5

    22

    27.4

    13.4

    17.8

    19.2

    23.8

    10W

    5

    0

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    0

    0

    20.2

    25

    12W

    5

    0

    0

    0

    0

    20.6

    26

    注:F:左股骨髁 T:左胫骨平台
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    从实验结果及表2可知,术后4W,B组(试验预防组)的平均病损分略低于A组(对照组),但差距不大,股骨(F)6.2∶8.4胫骨(T)8.2∶11.8:术后6W,B组平均病损积分明显低于A组,差距较大,F:9.8∶164,T:13.2∶20;术后8W:B组平均病损积分与A组差距进一步扩大,F:13.4∶22,T:17.8∶27.4;而C组,(试验治疗组,术后6W开始用药)平均病损积分与A组相近,无明显差别,F:20.6∶22,T:26∶27.4;术后10W、12W,C组平均病损积分稍有升高,但改变不大。

    而图1为各组造模侧胫、股骨软骨病损积分与术后时间点标趋势图,从图1可知,随时间的推移,各组病损均会加重,但是中药预防组(B组)的病损积分比空白对照组(A组)明显低:模型己成立后的治疗组(C组)病损积分随时间的推移,变化不大。均接近于8W后A组病损积分;所有胫骨平台损害比股骨髁的重。
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    图1 病损积分与术后时间点标趋势

    A∶A组股骨 A1∶A组胫骨

    B∶B组股骨 B1∶B组胫骨

    C∶C组股骨 C1∶C组胫骨

    讨论

    1 造模方法的选择

    本实验采用结扎一侧股静脉和臀下静脉及将结扎肢伸直位固定的方法造模,结扎下肢回流静脉造成静脉瘀滞,可产生骨内高压,出现早期膝DOA病变:8W时关节软骨表面粗糙,不光滑,颜色灰暗,失去正常光泽:12W时,关节软骨厚度开始降低,软骨细胞增生情况不明显,软骨细胞多出现变性改变。[4]本实验中,从术后4W的结果看,A组膝旁骨内压造模侧较对照例明显升高(P<0.01,结果见另文),但造模侧关节软骨退变轻微,因此,在较短的时间内,6W或8W,单纯结扎静脉,虽能产生膝旁骨内高压,但膝DOA明显的病变,却难以达到。而家兔膝关节伸直位固定35天就可造成DOA模型。[5]因此本实验采用两种方法叠加造模,从术后6W处死的标本分析,其造模成功率高,重复性良好,可以观察到家兔膝关节明显退变,软骨表层明显缺失,关节软骨溃疡,软骨细胞紊乱和软骨细胞丢失,纤维化及少量骨赘形成等,符合骨关节炎的病理改变。总体来说,此造模方法操作简单,创伤小、感染率低(术后感染仅3只),能保证膝旁骨内高压和关节软骨退变的阳性率。
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    2 关节软骨退变机理及补肾活血方药预防、治疗膝DOA疗效的分析

    目前,骨关节病的原因和发病机理仍不太清楚。过去许多人都相信关节软骨“消耗、磨损”的学说,认为这种关节软骨的病变是由于天长日久经常不断地机械性损伤的结果,因此,肥胖是其中的一个主要病因。而血运障碍,下肢骨内外静脉瘀滞,可致骨内压升高。骨内压升高后动静脉压差缩小,营养血管的血流减小,营养障碍可引起骨小梁坏死,坏死骨小梁修复中引起骨硬化,软骨下骨刚度增加,可导致退行性变。[6]此外,由于关节软骨浅层无血管供应,营养依靠滑液,因此,再生能力相当低,修复一般局限于软骨层的缺损,即缺损深度不超过软骨钙化层,以缺损边缘软骨基质内流的方式,呈现微小的内源性修复;[7]对全层关节软骨的缺损,1993年,Shapiro在兔股骨的髌髁关节面上钻一直径3mm的孔,深达软骨下骨,发现缺损可以被新生透明软骨修复,但修复组织最终不能取代缺损边缘软骨中3~8个细胞宽度的软骨变性坏死带,而更大的缺损则不能完成类似的修复。[8]因此软骨一旦发生变性坏死、脱落,修复就不那么容易,至于软骨外膜和滑膜的增生与骨化生则是继发性的代偿性病变。故当关节的损耗超过关节软骨的再生修复能力时就发生变性,关节损耗逐渐积累至一定程度就发生骨关节病。此外,本病的发生与基因、内分泌、性别、营养及机械与外伤等因素都有关系。[9]
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    膝DOA属中医,“痹症”、“膝痛”的范畴,作者以为其发病机制应为“本痿标痹”。[10]本痿一肝肾不足,随着年龄的增大,肝肾日渐衰惫,无以充盈筋骨,骨枯则髓减,骨质因而疏松,长期负重,骨骼因而变形或增生,筋不得滋润则不利关节活动:标痹——风寒湿痹,年老体虚,卫表防御功能下降则易为风寒湿邪入侵,痹阻不通:且本病大多起病缓慢,病情反复缠绵日久,根据中医久病入络的理论,故多数患者兼有瘀阻,因而立法方药方面以补益肝肾、活血通络为原则,筛选杜仲、补骨脂补肝肾,强筋骨为君药,治本,骨碎补补肝肾强筋骨的同时尚有活血之功,血竭活血通络,两药标本兼治,既补肝肾又活血,使血行则痹除,为臣药,再加熟地滋阴补肾为佐药,既加强补肾的功效又使全方药性温和,温而不燥。本实验B组(试验预防组)平均病损积分明显低于A组(空白对照组)的病损积分(P<0.01),因此可以说补肾活血方药具有预防实验性家兔膝DOA的作用,而C组(试验治疗组,术后6W开始用药)术后8W、10W、12W的平均病损积分差别不大,与8W后A组的病损积分相近(P>0.05),但关节滑膜的充血,肿胀程度及关节液的炎性变明显减轻,说明关节软骨发生较严重的损害后,单靠内服药物是难以修复的,但由于补肾活血方药能减轻关节的炎性变,因此对软骨的退变有较好的延缓作用。其作用机理可能为:一方面抑制滑膜炎性改变,减少滑膜炎性物质从滑膜释放入滑液,从而阻碍炎性滑膜对软骨滑膜的炎性破坏,另一方面通过滑液渗透直接作用于软骨细胞增强软骨细胞的代偿能力,调整软骨细胞的代谢如降解酶系的释放,向正常轨道逆转进而促进软骨机质中的代谢成份向正常方向改变,从而对软骨的降解起一定延缓作用。[10]
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    3 展望与不足

    退行性膝关节疾病以关节软骨退变为主,但目前临床治疗此类疾病疗效欠佳,而中医药预防治疗膝DOA有一定优势。本实验表明中药能明显延缓兔膝关节软骨退变,减轻或改善膝DOA的发生和发展,但动物模型毕竟与人膝DOA有一定差异,因此尚需开展临床研究,进一步探讨中药防治关节软骨退变的机理。

    基金项目:广东省中医药管理局基金资助(96134)

    作者简介:王羽丰(1974-),男(汉族),江苏省南京市人,广州中医药大学,硕士研究生。

    参考文献

    [1] 赵文海,郝东明.骨性关节炎的现代研究及进展.吉林中医药,1992,4:42~43
, 百拇医药
    [2] 陆裕朴.实用骨科学.北京:人民卫生出版社,1993,1440

    [3] C.Colombo,et al.a new model of osteoarthritis in rabbits.Arthritis and Rheumatism,1983,26(7):875~885

    [4] 孙刚,王永惕.骨内静脉瘀滞.骨内高压在骨性关节炎发病中作用探讨.中华骨科杂志,1991,11(5):374~376

    [5] 邱贵兴,王桂生.兔膝关节制动引起关节软骨退变的实验研究.中华外科杂志,1987,25(3):175~177

    [6] Brookes M.The vascular factor in osteoarthritis.Surg Gunec Obstet,1996,123:1255~1257
, http://www.100md.com
    [7] Briteberg M,Nilsson A,Lilndahl A,et al.Rabbit articular cartilage treated with autologus cultuned chondrocytes.Clin Orthop,1996,326:270~283

    [8] Shapiro F,Koide S,Glrcher MJ.Cell origin and differention in the repair of full-thickness defects of articular cartilage.J Bone Joint Surg(Am),1993,75:532~553

    [9] 娄思权.骨关节炎的病理与发病因素.中华骨科杂志,1996,16(1):56~59

    [10] 沈培芝,石印玉,陈友红,等.强筋方治疗试验性膝骨关节炎的组织病理学观察研究.中国中医骨伤科,1995,3(1):10~13

    收稿日期:1999-01-20, 百拇医药