麻疹 流行性腮腺炎和风疹联合疫苗(上)
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37c医学网
作者：Maurice R.Hilleman
单位：Maurice R.Hilleman(美国默克公司，美国新泽西州白宫站)
关键词：
中国计划免疫000540 1 导言
麻疹、流行性腮腺炎(以下简称“腮腺炎”)和风疹联合疫苗(M-M-RTM)是建立在成功地开发各个单价疫苗成分基础上的。当时还开发了麻疹-腮腺炎(M-M-VAXTM)、麻疹-风疹(M-R-VAXTM)以及腮腺炎-风疹(BIAVAXTM)等一系列联合疫苗(上述所有疫苗均由位于美国新泽西州白宫站的美国默克公司开发)。开发联合疫苗面临的障碍是如何保证获得像单价疫苗一样良好的免疫应答，而又不增加其反应原性，配方上兼容以确保在干燥及贮存时疫苗效价的稳定，以及疫苗质量控制以便定量地测定各种疫苗病毒成分的效价。
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麻疹、腮腺炎和风疹疫苗所作出的贡献，不管是单价疫苗还是联合疫苗，都是不可估量的。美国自从开始应用这些疫苗之后10年间，这3种疾病已经降低到了无足轻重的地步。所有这3种疫苗病毒都具有稳定的抗原特异性，表明在全世界消灭这些疾病是指日可待的。
开发联合疫苗是一个冗长而又乏味的过程，首先需要成功地开发出各个单价疫苗，其次是将已有的单价疫苗安全有效地组合在一起。麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗(M-M-RTM)的成功，实现了我们从研制单价疫苗到一针双价疫苗，最后三价疫苗联合应用的长期计划[1]。M-M-RTM是在1971年获得批准的，在这之前唯一的活病毒联合疫苗是在1967年批准的麻疹和天花疫苗[2～4]。单价疫苗或者联合疫苗的设计是针对当时特定的需求，独立地或者全面地解决问题，M-M-RTM就是一个无可争辩的成功案例。
2 共同的问题
, 百拇医药
2.1 选择制备疫苗的母系病毒株的问题 在研制麻疹、腮腺炎和风疹单价疫苗临床试验中所面临的共同问题(表1)是缺乏适宜的动物模型，以便在疫苗应用到人体之前提供可靠的临床前安全性和有效性的评估。因此，在疫苗的开发过程中，更多的是通过判断而不是依赖数据的指引。确定适当的传代水平以保证对人体的安全性，是通过在相应的鸡胚细胞序列或者细胞传代水平(假定与减毒程度有关)建立不同批号的疫苗，然后在志愿者身上进行测试。这项工作相当困难而且耗费巨大，因为每批测试的疫苗必须类同于实际的疫苗批量生产，并且符合美国联邦管理当局[现在是食品及药物管理局(FDA)]对于商业化产品一样的严格标准。最大的难题是需要及时作出判断，在哪一个减毒周期后可以终止，进入第1次临床试验。只要在某个传代水平上确立了疫苗的总体安全性，而后循序追踪地确定出最佳的临床反应/效价之间的关系就属于常规工作了。
表1 开发活病毒疫苗中的特殊问题 选择制备疫苗的母系病毒株
在缺乏动物模型的情况下，只能通过动物数据来评估麻疹、腮腺炎和风疹病毒在不同减毒阶段对于人的安全性和反应原性。
, 百拇医药
利用其固有的遗传缺陷筛选出适宜的减毒株。
去除自身病毒
用作细胞培养的鸡胚中受到家禽造白细胞组织增生的污染。
选用无家禽造白细胞组织增生病毒污染鸡群的鸡胚细胞。
开发疫苗株的第2个障碍是实际上临床所获得的各个病毒分离株具有完全不同的遗传特性，其中大多数因为在免疫原性与减毒之间不能够达到令人满意的平衡而不得不遭淘汰。这个问题对于腮腺炎疫苗来说显得尤为困难[5]，因为病毒在鸡胚/细胞中减毒非常迅速，要获得临床上有效的产品仅限于非常狭窄的几代细胞系列中。造成研究困难的另一个原因是需要进行大量的血清中和试验来评估疫苗抗体应答的敏感性和可靠性[6]。
2.2 原代鸡胚细胞培养中自身病毒的问题 1961年在实验室开发Edmonston B麻疹病毒[7]及其进一步减毒系列(Moraten line)[8]时，所面临的主要问题是在鸡胚细胞及培养过程中毫无例外地都受到了逆转录病毒的污染。这种逆转录病毒来自于家禽造白细胞组织增生的复合物，其中包括白血病，而且在当时体外测试中无法予以检测。根据我们多年来应用鸡胚培养黄热病疫苗的经验，这些病毒看来并不会对人体造成不良后果。但是，我们下定决心坚决不能够让白血病活病毒存在，使人体受到任何潜在的，即便是遥远的副作用威胁。
, 百拇医药
为了解决造白细胞组织增生的问题，我们专门开发了抵抗力诱导因子(RIF)试验[9]，这样就可以在体外检测出家禽造白细胞组织增生复合物的病毒。根据鸡群生下的蛋中是否含有抗造白细胞组织增生的抗体，Hughes等[10]建立了无造白细胞组织增生病毒污染的实验鸡群。采用这些无污染的原始鸡群所生下的鸡胚细胞，就可以准备进行实验室开发和常规生产无造白细胞组织增生病毒污染的麻疹疫苗细胞培养了。一旦完成了这种无污染的细胞培养，就可以制备不受造白细胞组织增生病毒污染的麻疹疫苗以及腮腺炎疫苗。
3 单价疫苗开发过程中的障碍及其解决方案
表2总结了在开发麻疹、腮腺炎和风疹单价疫苗中所面临的主要问题及其解决方案。
表2 疫苗开发中进展及障碍 疫苗批准
障碍
, 百拇医药
解决方案
麻疹
1963-RUBEOVAXTM
毒性过强
合并使用免疫球
(Edmonston B)
蛋白
1968-ATTENUVAXTM
进一步减毒
充分减毒
(Moraten)
腮腺炎
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1967-MUMPSVAXTM
减毒
减毒恰到好处
(Jeryl LynnTM)
风疹
(Merck Benoit duck)
繁殖并减毒
鸭细胞繁殖，充分减毒
1969-MERUVAXTM
毒性过强-进一
在鸭细胞中减毒
, 百拇医药
(HPV-77duck)a
步减毒
1978-MERUVAXⅡTM
减少关节炎
从外部转让
(RA27/3-MRC-5)
a同时进行妊娠妇女接触接种疫苗的儿童的风险评估。
3.1 麻疹 Enders的减毒EdmonstonB疫苗[11]一开始就受到了2个主要问题的困扰：临床上反应性过大，以及用作病毒培养的鸡胚细胞受到大量的家禽造白细胞组织增生的污染；第2个问题前面已经讨论过了。对于临床反应性过大这个问题的最初解决方案是，在接种疫苗同时，在另一侧上臂注射标准的麻疹免疫球蛋白。需要同时接种免疫球蛋白的RUBEOVAXTM是在1963年获得批准的。免疫球蛋白仅仅是一种临时解决方案，关键是要对病毒进行进一步减毒。最后是将Edmonston病毒在受精的鸡蛋上多次传代，从而获得Enders病毒进一步减毒的Moraten系列。新的疫苗在1968年获得批准，命名为ATTENUVAXTM。
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3.2 腮腺炎 在测试的各种腮腺炎病毒中，Jeryl LynnTM病毒株脱颖而出，具有减毒恰到好处的特性。MUMPSVAXTM疫苗是在1965年获得批准。有关腮腺炎疫苗研究在本文后面章节中详细探讨。
3.3 风疹 风疹疫苗的批准是一系列开拓性研究的结果。当时从一个叫Benoit的小孩身上分离出风疹病毒株，然后经过鸭胚细胞培养减毒，形成Merck Benoit株[12～17]。HPV-77株是由Parkman和Meyer[18]在牛肾细胞培养中生长的，作为Benoit株的替代品，主要是为了满足预计的需求，应付政治上压力，以便在单一疫苗上进行快速的培养，而不至于因为进行两种不同的疫苗病毒培养而减缓速度，当时的情形要求尽快扭转美国又一次可能的风疹流行。HPV-77牛肾细胞病毒疫苗[18]由于临床反应性过大，从来未获得批准。但是，HPV-77牛肾细胞株进一步减毒后，形成HPV-77鸭胚细胞株，最后在1969年获得批准(MERUVAXTM)[16～20]。后来，HPV-77鸭胚细胞疫苗被RA27/3人二倍体细胞培养生长的病毒株所替代[21]，在1978年同以MERUVAXⅡTM的名字注册批准[22，23]。选用后一种病毒株是因为它对于成年女性造成的关节症状较少，并且在预防亚临床感染以及疫苗接种后再次接触野病毒而产生隐性感染方面具有更好的优势。
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4 联合疫苗
麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗的开发需要提供足够的证据证明联合疫苗具有像单价疫苗一样良好的免疫应答，同时又不增加其反应原性，配方上的兼容应确保在干燥及储存时疫苗效价的稳定和质量控制，以便定量地测定各种疫苗病毒成分的效价。
3种疫苗成分的赋形剂在二联或三联疫苗配方中是相互兼容的，在4℃条件下长期贮存不会改变其免疫效价(感染滴度)的稳定性。主要障碍是不同疫苗病毒成分在竞争性地诱导宿主免疫应答之间的相互干扰。解决的方法是调整联合疫苗中各种病毒成分的剂量，以达到令人满意的平衡。
确定平衡的方法在于精确定量地制备不同成分比例的联合疫苗，然后在易感儿童身上进行测试。再将结果与在同一项研究中接受标准配方单价疫苗的易感儿童进行比较。按照这个机理，确定了二联和三联疫苗的配方，既不降低疫苗的免疫应答，也不增加其反应原性。根据这些数据，一批二联[24～26]和三联疫苗[23，27，28]陆续获得批准，得到广泛应用，详见表3。M-M-RTM[27，28]和M-M-RⅡD○R[23]就是多年来长期努力最后成功的结晶，是美国开展麻疹、腮腺炎和风疹疫苗接种的主要驱动力，也成为美国、加拿大及欧洲等地应用活病毒疫苗的成功典范，目前正逐步推广到部分发展中国家。麻疹疫苗问世后不久就在全世界得到了广泛应用，1974年被纳入到世界卫生组织(WHO)推荐的扩大免疫规划(EPI)项目，成为6种推荐疫苗之一。
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表3 已经批准的麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗 1970
BIAVAXTM腮腺炎(Jeryl LynnTM)和风疹(HPV-77鸭)联合疫苗
1971
M-R-VAXTM麻疹(Moraten)和风疹(HPV-77鸭)联合疫苗
1971
M-M-RTM麻疹(Moraten)，腮腺炎(Jeryl LynnTM)和风疹(HPV-77鸭)联合疫苗
1978
M-M-R ⅡD○R麻疹(Moraten)，腮腺炎(Jeryl LynnTM)和风疹(RA27/3)联合疫苗
, 百拇医药
4.1 各种不同腮腺炎病毒疫苗开发及其应用的特殊考虑 腮腺炎病毒疫苗开发应用过程，总体上代表了疫苗开发及其应用中所面临的一些特殊问题。为了说明起见，特将Jeryl LynnTM株腮腺炎活病毒疫苗开发中的具体经验总结如下。
4.1.1 背景 早年试图开发腮腺炎疫苗的努力，不管是灭活疫苗还是活病毒疫苗，最后都以失败而告终，无法获得疫苗所需要的高保护效价、持久免疫性及无致病性[29～31]。我们所开发的Jeryl LynnTM株腮腺炎减毒活疫苗[32，33]具有理想的临床上无反应性、高保护效价及持久免疫性[34，35]，在腮腺炎疫苗开发中具有独一无二的优势。
4.1.2 Jeryl LynnTM腮腺炎减毒株 1963年3月23日，在一位患有腮腺炎的5岁儿童(Jeryl Lynn)喉咽部所采集的病毒株，最后制成了Jeryl LynnTM株腮腺炎疫苗[5，32，36～38]。经过一系列临床测试，传代A水平(总共在鸡胚和鸡胚细胞培养中传代12次)以及B水平(总共传代17次或18次，鸡胚中12次，细胞培养中5次或6次)，病毒株被用来作进一步临床研究。表4概要地报告了有关发现[5]。显而易见，疫苗A和B都具有免疫原性，但只有B水平疫苗无明显的临床反应，因此，留作进一步研究。疫苗株经过27次传代后已经无足够的免疫原性，不再继续研究下去。所有的疫苗株都进行干燥处理。表4 Jeryl LynnTM株腮腺炎疫苗
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A和B的临床及免疫应答 传代
水平
临床a
中和抗体
应答a
腮腺炎
病毒分离
血清淀粉酶升高
A(12)
4/16
3/16
0/16
, 百拇医药
16/16
B(17)
0/14
0/14
0/14
14/14
a阳性数/测试总人数。
4.1.3 安全性和有效性的证据 确定疫苗的安全性和保护有效性的研究(表5)是在费城Havertown-Springfield地区居住的867名原本血清阴性的儿童中进行的[37，38]。疫苗接种后98%的儿童产生了中和抗体。表5概要地报告了总有效保护水平为98%左右，与中和抗体阳性反应相关。免疫接种后的临床反应主要为注射部位的局部炎症。
, 百拇医药
表5 腮腺炎疫苗保护有效性对照研究a：疫苗接种后
再次接触腮腺炎病毒感染的儿童中确诊为腮腺炎的病例 接触地点
腮腺炎确诊病例数/总接触人数
接种者
对照组
有效保护(%)
教室
0/14
22/24
100
家庭
, 百拇医药 2/86
39/76
96
a原本血清阴性的867人中，362名接种疫苗，505名未接种者作为对照组。
4.2 腮腺炎病毒族群内及族群间半亚型和群型问题 腮腺炎病毒[30]属于副粘液病毒组中真副粘液病毒。腮腺炎病毒基因的遗传序列详见图1。目前，表6显示了应用基因测序方法分离出7种基因，据认为共有6个结构蛋白加上2个非结构蛋白和SH蛋白。高度变异的SH蛋白是疏水的，其结构或非结构蛋白状态不明。
图1 腮腺炎病毒基因图显示基因和基因间序列
(选自Rima，B.G.，的病毒百科全书，Webster.R.G.and
, 百拇医药
Granoff，A.(eds.)，Academic Press，New York，1994，p.876)
表6 腮腺炎病毒基因的编码蛋白 N
核衣壳蛋白
结构
P
磷酸蛋白
结构
M
基质
结构
F
融合蛋白
, 百拇医药
结构
HN
血细胞凝集素-神经氨酸酶
结构
L
大蛋白
结构
NS1
蛋白1
非结构
NS2
蛋白2
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非结构
SH
小疏水蛋白
结构或非结构
病毒，尤其是属于某一特定种属的RNA病毒，在遗传组成上有较大的差异。在同一患者以及在体外培养中获得的不同病毒株也可能有相当大的差异。根据其遗传相关程度，病毒分离株可以形成不同的病毒族群。总体来看，这些差异是确定多种半亚型的基础，而不是严格的种群组合。
根据对高度变异的SH区基因分析(图1)，Jeryl LynnTM腮腺炎病毒[39]是由2个非常相似但又有区别的半亚型组成，命名为JL2和JL5。不知道这些变异是在原来患者身上就存在，还是在减毒过程中经鸡胚和细胞培养系列传代中交叉获得的。也不知道在Jeryl LynnTM腮腺炎疫苗株或者其它腮腺炎病毒疫苗中有多少这样的SH变异。重要的是SH区变异对于疫苗本身并不重要，对疫苗的毒性和保护效价都无影响。有关疫苗的安全性，英国药政当局的Afzal等[39]注意到在疫苗生产过程中疫苗主病毒种的控制传代系统“保证了稳定的可重复的免疫原性、安全性和耐受性特征”，因此，“产品能够保持质量上的持续稳定以及临床上安全性和有效性的优异记录”。
, 百拇医药
重要的是，已经证明腮腺炎减毒株和野病毒株，根据其遗传组成上的差异，大致可以分成3[39]或4[40]个完全不同的族群。更为重要的是，Jeryl LynnTM疫苗株，俄罗斯的Leningrad-3疫苗株[41]以及日本的Urabe-AM9疫苗株[42～48]分属于不同的族群。很有可能就是由于病毒株之间遗传特性上的差异，造成了它们具有的神经毒性差别，详见下文。
4.3 后续的研究 在其它一系列研究中证明了疫苗对成人及儿童均有同等的免疫原性和无反应性[49]。并进一步确定[50，51]为达到97%以上的儿童或成人有效免疫力，每次剂量所需要的最低病毒数约为317个半数细胞培养感染单位(TCID50)。而疫苗常规应用的每次剂量为2万TCID50。干燥后的疫苗在冰箱中贮存稳定[32，52]，接种后儿童与易感儿童接触无病毒传播[32]。已证明其免疫原性是持久的，一直延续至今[34，35]。
至于接种疫苗后接触腮腺炎病毒是否会出现亚临床再感染，以及有关免疫的基础尚不清楚。有报道说，在自然感染后可能会出现临床上可以辨别的再感染，虽然发生率甚低[53]。因而可以推测，就像麻疹和风疹一样，可以发生亚临床再感染，但局限于呼吸道粘膜细胞。可以假定免疫的主要机理是通过抗体中和病毒。因为，在大多数病毒感染中，由于细胞毒性T细胞反应，很快地清除了受病毒感染的细胞，因而再感染往往呈一过性并且是亚临床的。对于腮腺炎来说也可能是同样如此。据此，也可以推测长期免疫是建筑在B细胞、T辅助细胞以及细胞毒性T细胞的免疫记忆基础之上的。, 百拇医药
单位：Maurice R.Hilleman(美国默克公司，美国新泽西州白宫站)
关键词：
中国计划免疫000540 1 导言
麻疹、流行性腮腺炎(以下简称“腮腺炎”)和风疹联合疫苗(M-M-RTM)是建立在成功地开发各个单价疫苗成分基础上的。当时还开发了麻疹-腮腺炎(M-M-VAXTM)、麻疹-风疹(M-R-VAXTM)以及腮腺炎-风疹(BIAVAXTM)等一系列联合疫苗(上述所有疫苗均由位于美国新泽西州白宫站的美国默克公司开发)。开发联合疫苗面临的障碍是如何保证获得像单价疫苗一样良好的免疫应答，而又不增加其反应原性，配方上兼容以确保在干燥及贮存时疫苗效价的稳定，以及疫苗质量控制以便定量地测定各种疫苗病毒成分的效价。
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麻疹、腮腺炎和风疹疫苗所作出的贡献，不管是单价疫苗还是联合疫苗，都是不可估量的。美国自从开始应用这些疫苗之后10年间，这3种疾病已经降低到了无足轻重的地步。所有这3种疫苗病毒都具有稳定的抗原特异性，表明在全世界消灭这些疾病是指日可待的。
开发联合疫苗是一个冗长而又乏味的过程，首先需要成功地开发出各个单价疫苗，其次是将已有的单价疫苗安全有效地组合在一起。麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗(M-M-RTM)的成功，实现了我们从研制单价疫苗到一针双价疫苗，最后三价疫苗联合应用的长期计划[1]。M-M-RTM是在1971年获得批准的，在这之前唯一的活病毒联合疫苗是在1967年批准的麻疹和天花疫苗[2～4]。单价疫苗或者联合疫苗的设计是针对当时特定的需求，独立地或者全面地解决问题，M-M-RTM就是一个无可争辩的成功案例。
2 共同的问题
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2.1 选择制备疫苗的母系病毒株的问题 在研制麻疹、腮腺炎和风疹单价疫苗临床试验中所面临的共同问题(表1)是缺乏适宜的动物模型，以便在疫苗应用到人体之前提供可靠的临床前安全性和有效性的评估。因此，在疫苗的开发过程中，更多的是通过判断而不是依赖数据的指引。确定适当的传代水平以保证对人体的安全性，是通过在相应的鸡胚细胞序列或者细胞传代水平(假定与减毒程度有关)建立不同批号的疫苗，然后在志愿者身上进行测试。这项工作相当困难而且耗费巨大，因为每批测试的疫苗必须类同于实际的疫苗批量生产，并且符合美国联邦管理当局[现在是食品及药物管理局(FDA)]对于商业化产品一样的严格标准。最大的难题是需要及时作出判断，在哪一个减毒周期后可以终止，进入第1次临床试验。只要在某个传代水平上确立了疫苗的总体安全性，而后循序追踪地确定出最佳的临床反应/效价之间的关系就属于常规工作了。
表1 开发活病毒疫苗中的特殊问题 选择制备疫苗的母系病毒株
在缺乏动物模型的情况下，只能通过动物数据来评估麻疹、腮腺炎和风疹病毒在不同减毒阶段对于人的安全性和反应原性。
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利用其固有的遗传缺陷筛选出适宜的减毒株。
去除自身病毒
用作细胞培养的鸡胚中受到家禽造白细胞组织增生的污染。
选用无家禽造白细胞组织增生病毒污染鸡群的鸡胚细胞。
开发疫苗株的第2个障碍是实际上临床所获得的各个病毒分离株具有完全不同的遗传特性，其中大多数因为在免疫原性与减毒之间不能够达到令人满意的平衡而不得不遭淘汰。这个问题对于腮腺炎疫苗来说显得尤为困难[5]，因为病毒在鸡胚/细胞中减毒非常迅速，要获得临床上有效的产品仅限于非常狭窄的几代细胞系列中。造成研究困难的另一个原因是需要进行大量的血清中和试验来评估疫苗抗体应答的敏感性和可靠性[6]。
2.2 原代鸡胚细胞培养中自身病毒的问题 1961年在实验室开发Edmonston B麻疹病毒[7]及其进一步减毒系列(Moraten line)[8]时，所面临的主要问题是在鸡胚细胞及培养过程中毫无例外地都受到了逆转录病毒的污染。这种逆转录病毒来自于家禽造白细胞组织增生的复合物，其中包括白血病，而且在当时体外测试中无法予以检测。根据我们多年来应用鸡胚培养黄热病疫苗的经验，这些病毒看来并不会对人体造成不良后果。但是，我们下定决心坚决不能够让白血病活病毒存在，使人体受到任何潜在的，即便是遥远的副作用威胁。
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为了解决造白细胞组织增生的问题，我们专门开发了抵抗力诱导因子(RIF)试验[9]，这样就可以在体外检测出家禽造白细胞组织增生复合物的病毒。根据鸡群生下的蛋中是否含有抗造白细胞组织增生的抗体，Hughes等[10]建立了无造白细胞组织增生病毒污染的实验鸡群。采用这些无污染的原始鸡群所生下的鸡胚细胞，就可以准备进行实验室开发和常规生产无造白细胞组织增生病毒污染的麻疹疫苗细胞培养了。一旦完成了这种无污染的细胞培养，就可以制备不受造白细胞组织增生病毒污染的麻疹疫苗以及腮腺炎疫苗。
3 单价疫苗开发过程中的障碍及其解决方案
表2总结了在开发麻疹、腮腺炎和风疹单价疫苗中所面临的主要问题及其解决方案。
表2 疫苗开发中进展及障碍 疫苗批准
障碍
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解决方案
麻疹
1963-RUBEOVAXTM
毒性过强
合并使用免疫球
(Edmonston B)
蛋白
1968-ATTENUVAXTM
进一步减毒
充分减毒
(Moraten)
腮腺炎
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1967-MUMPSVAXTM
减毒
减毒恰到好处
(Jeryl LynnTM)
风疹
(Merck Benoit duck)
繁殖并减毒
鸭细胞繁殖，充分减毒
1969-MERUVAXTM
毒性过强-进一
在鸭细胞中减毒
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(HPV-77duck)a
步减毒
1978-MERUVAXⅡTM
减少关节炎
从外部转让
(RA27/3-MRC-5)
a同时进行妊娠妇女接触接种疫苗的儿童的风险评估。
3.1 麻疹 Enders的减毒EdmonstonB疫苗[11]一开始就受到了2个主要问题的困扰：临床上反应性过大，以及用作病毒培养的鸡胚细胞受到大量的家禽造白细胞组织增生的污染；第2个问题前面已经讨论过了。对于临床反应性过大这个问题的最初解决方案是，在接种疫苗同时，在另一侧上臂注射标准的麻疹免疫球蛋白。需要同时接种免疫球蛋白的RUBEOVAXTM是在1963年获得批准的。免疫球蛋白仅仅是一种临时解决方案，关键是要对病毒进行进一步减毒。最后是将Edmonston病毒在受精的鸡蛋上多次传代，从而获得Enders病毒进一步减毒的Moraten系列。新的疫苗在1968年获得批准，命名为ATTENUVAXTM。
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3.2 腮腺炎 在测试的各种腮腺炎病毒中，Jeryl LynnTM病毒株脱颖而出，具有减毒恰到好处的特性。MUMPSVAXTM疫苗是在1965年获得批准。有关腮腺炎疫苗研究在本文后面章节中详细探讨。
3.3 风疹 风疹疫苗的批准是一系列开拓性研究的结果。当时从一个叫Benoit的小孩身上分离出风疹病毒株，然后经过鸭胚细胞培养减毒，形成Merck Benoit株[12～17]。HPV-77株是由Parkman和Meyer[18]在牛肾细胞培养中生长的，作为Benoit株的替代品，主要是为了满足预计的需求，应付政治上压力，以便在单一疫苗上进行快速的培养，而不至于因为进行两种不同的疫苗病毒培养而减缓速度，当时的情形要求尽快扭转美国又一次可能的风疹流行。HPV-77牛肾细胞病毒疫苗[18]由于临床反应性过大，从来未获得批准。但是，HPV-77牛肾细胞株进一步减毒后，形成HPV-77鸭胚细胞株，最后在1969年获得批准(MERUVAXTM)[16～20]。后来，HPV-77鸭胚细胞疫苗被RA27/3人二倍体细胞培养生长的病毒株所替代[21]，在1978年同以MERUVAXⅡTM的名字注册批准[22，23]。选用后一种病毒株是因为它对于成年女性造成的关节症状较少，并且在预防亚临床感染以及疫苗接种后再次接触野病毒而产生隐性感染方面具有更好的优势。
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4 联合疫苗
麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗的开发需要提供足够的证据证明联合疫苗具有像单价疫苗一样良好的免疫应答，同时又不增加其反应原性，配方上的兼容应确保在干燥及储存时疫苗效价的稳定和质量控制，以便定量地测定各种疫苗病毒成分的效价。
3种疫苗成分的赋形剂在二联或三联疫苗配方中是相互兼容的，在4℃条件下长期贮存不会改变其免疫效价(感染滴度)的稳定性。主要障碍是不同疫苗病毒成分在竞争性地诱导宿主免疫应答之间的相互干扰。解决的方法是调整联合疫苗中各种病毒成分的剂量，以达到令人满意的平衡。
确定平衡的方法在于精确定量地制备不同成分比例的联合疫苗，然后在易感儿童身上进行测试。再将结果与在同一项研究中接受标准配方单价疫苗的易感儿童进行比较。按照这个机理，确定了二联和三联疫苗的配方，既不降低疫苗的免疫应答，也不增加其反应原性。根据这些数据，一批二联[24～26]和三联疫苗[23，27，28]陆续获得批准，得到广泛应用，详见表3。M-M-RTM[27，28]和M-M-RⅡD○R[23]就是多年来长期努力最后成功的结晶，是美国开展麻疹、腮腺炎和风疹疫苗接种的主要驱动力，也成为美国、加拿大及欧洲等地应用活病毒疫苗的成功典范，目前正逐步推广到部分发展中国家。麻疹疫苗问世后不久就在全世界得到了广泛应用，1974年被纳入到世界卫生组织(WHO)推荐的扩大免疫规划(EPI)项目，成为6种推荐疫苗之一。
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表3 已经批准的麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗 1970
BIAVAXTM腮腺炎(Jeryl LynnTM)和风疹(HPV-77鸭)联合疫苗
1971
M-R-VAXTM麻疹(Moraten)和风疹(HPV-77鸭)联合疫苗
1971
M-M-RTM麻疹(Moraten)，腮腺炎(Jeryl LynnTM)和风疹(HPV-77鸭)联合疫苗
1978
M-M-R ⅡD○R麻疹(Moraten)，腮腺炎(Jeryl LynnTM)和风疹(RA27/3)联合疫苗
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4.1 各种不同腮腺炎病毒疫苗开发及其应用的特殊考虑 腮腺炎病毒疫苗开发应用过程，总体上代表了疫苗开发及其应用中所面临的一些特殊问题。为了说明起见，特将Jeryl LynnTM株腮腺炎活病毒疫苗开发中的具体经验总结如下。
4.1.1 背景 早年试图开发腮腺炎疫苗的努力，不管是灭活疫苗还是活病毒疫苗，最后都以失败而告终，无法获得疫苗所需要的高保护效价、持久免疫性及无致病性[29～31]。我们所开发的Jeryl LynnTM株腮腺炎减毒活疫苗[32，33]具有理想的临床上无反应性、高保护效价及持久免疫性[34，35]，在腮腺炎疫苗开发中具有独一无二的优势。
4.1.2 Jeryl LynnTM腮腺炎减毒株 1963年3月23日，在一位患有腮腺炎的5岁儿童(Jeryl Lynn)喉咽部所采集的病毒株，最后制成了Jeryl LynnTM株腮腺炎疫苗[5，32，36～38]。经过一系列临床测试，传代A水平(总共在鸡胚和鸡胚细胞培养中传代12次)以及B水平(总共传代17次或18次，鸡胚中12次，细胞培养中5次或6次)，病毒株被用来作进一步临床研究。表4概要地报告了有关发现[5]。显而易见，疫苗A和B都具有免疫原性，但只有B水平疫苗无明显的临床反应，因此，留作进一步研究。疫苗株经过27次传代后已经无足够的免疫原性，不再继续研究下去。所有的疫苗株都进行干燥处理。表4 Jeryl LynnTM株腮腺炎疫苗
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A和B的临床及免疫应答 传代
水平
临床a
中和抗体
应答a
腮腺炎
病毒分离
血清淀粉酶升高
A(12)
4/16
3/16
0/16
, 百拇医药
16/16
B(17)
0/14
0/14
0/14
14/14
a阳性数/测试总人数。
4.1.3 安全性和有效性的证据 确定疫苗的安全性和保护有效性的研究(表5)是在费城Havertown-Springfield地区居住的867名原本血清阴性的儿童中进行的[37，38]。疫苗接种后98%的儿童产生了中和抗体。表5概要地报告了总有效保护水平为98%左右，与中和抗体阳性反应相关。免疫接种后的临床反应主要为注射部位的局部炎症。
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表5 腮腺炎疫苗保护有效性对照研究a：疫苗接种后
再次接触腮腺炎病毒感染的儿童中确诊为腮腺炎的病例 接触地点
腮腺炎确诊病例数/总接触人数
接种者
对照组
有效保护(%)
教室
0/14
22/24
100
家庭
, 百拇医药 2/86
39/76
96
a原本血清阴性的867人中，362名接种疫苗，505名未接种者作为对照组。
4.2 腮腺炎病毒族群内及族群间半亚型和群型问题 腮腺炎病毒[30]属于副粘液病毒组中真副粘液病毒。腮腺炎病毒基因的遗传序列详见图1。目前，表6显示了应用基因测序方法分离出7种基因，据认为共有6个结构蛋白加上2个非结构蛋白和SH蛋白。高度变异的SH蛋白是疏水的，其结构或非结构蛋白状态不明。
图1 腮腺炎病毒基因图显示基因和基因间序列
(选自Rima，B.G.，的病毒百科全书，Webster.R.G.and
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Granoff，A.(eds.)，Academic Press，New York，1994，p.876)
表6 腮腺炎病毒基因的编码蛋白 N
核衣壳蛋白
结构
P
磷酸蛋白
结构
M
基质
结构
F
融合蛋白
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结构
HN
血细胞凝集素-神经氨酸酶
结构
L
大蛋白
结构
NS1
蛋白1
非结构
NS2
蛋白2
, http://www.100md.com
非结构
SH
小疏水蛋白
结构或非结构
病毒，尤其是属于某一特定种属的RNA病毒，在遗传组成上有较大的差异。在同一患者以及在体外培养中获得的不同病毒株也可能有相当大的差异。根据其遗传相关程度，病毒分离株可以形成不同的病毒族群。总体来看，这些差异是确定多种半亚型的基础，而不是严格的种群组合。
根据对高度变异的SH区基因分析(图1)，Jeryl LynnTM腮腺炎病毒[39]是由2个非常相似但又有区别的半亚型组成，命名为JL2和JL5。不知道这些变异是在原来患者身上就存在，还是在减毒过程中经鸡胚和细胞培养系列传代中交叉获得的。也不知道在Jeryl LynnTM腮腺炎疫苗株或者其它腮腺炎病毒疫苗中有多少这样的SH变异。重要的是SH区变异对于疫苗本身并不重要，对疫苗的毒性和保护效价都无影响。有关疫苗的安全性，英国药政当局的Afzal等[39]注意到在疫苗生产过程中疫苗主病毒种的控制传代系统“保证了稳定的可重复的免疫原性、安全性和耐受性特征”，因此，“产品能够保持质量上的持续稳定以及临床上安全性和有效性的优异记录”。
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重要的是，已经证明腮腺炎减毒株和野病毒株，根据其遗传组成上的差异，大致可以分成3[39]或4[40]个完全不同的族群。更为重要的是，Jeryl LynnTM疫苗株，俄罗斯的Leningrad-3疫苗株[41]以及日本的Urabe-AM9疫苗株[42～48]分属于不同的族群。很有可能就是由于病毒株之间遗传特性上的差异，造成了它们具有的神经毒性差别，详见下文。
4.3 后续的研究 在其它一系列研究中证明了疫苗对成人及儿童均有同等的免疫原性和无反应性[49]。并进一步确定[50，51]为达到97%以上的儿童或成人有效免疫力，每次剂量所需要的最低病毒数约为317个半数细胞培养感染单位(TCID50)。而疫苗常规应用的每次剂量为2万TCID50。干燥后的疫苗在冰箱中贮存稳定[32，52]，接种后儿童与易感儿童接触无病毒传播[32]。已证明其免疫原性是持久的，一直延续至今[34，35]。
至于接种疫苗后接触腮腺炎病毒是否会出现亚临床再感染，以及有关免疫的基础尚不清楚。有报道说，在自然感染后可能会出现临床上可以辨别的再感染，虽然发生率甚低[53]。因而可以推测，就像麻疹和风疹一样，可以发生亚临床再感染，但局限于呼吸道粘膜细胞。可以假定免疫的主要机理是通过抗体中和病毒。因为，在大多数病毒感染中，由于细胞毒性T细胞反应，很快地清除了受病毒感染的细胞，因而再感染往往呈一过性并且是亚临床的。对于腮腺炎来说也可能是同样如此。据此，也可以推测长期免疫是建筑在B细胞、T辅助细胞以及细胞毒性T细胞的免疫记忆基础之上的。, 百拇医药