地中海贫血患者珠蛋白基因mRNA和肽链水平的检测及其相关性分析
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作者：邹奕 杜传书 曾瑞萍 李洪义
单位：(中山医科大学遗传教研室 510089)
关键词：β地中海贫血；珠蛋白肽链；β珠蛋白mRNA；血红蛋白电泳
广东医学001008
【摘要】目的 研究β地中海贫血(简称地贫)患者外周血中α,β,γ珠蛋白基因mRNA和肽链的相对含量，为进一步研究珠蛋白基因表达的调控提供基础。方法 应用半定量RT-PCR和血红蛋白电泳，以α珠蛋白基因mRNA和α珠蛋白链为内对照，检测了正常人和β地贫患者外周血中β和γ珠蛋白基因和肽链的相对含量。结果 β地贫患者外周血中β珠蛋白基因mRNA和β珠蛋白肽链都有不同程度的减少和γ珠蛋白基因产物代偿性增高，同时两者水平呈负相关。结论 β和γ珠蛋白基因在转录和翻译水平都存在竞争性反馈调节机制，随着β珠蛋白基因产物的减少γ珠蛋白基因产物相应升高。
, 百拇医药
Determination and correlation analysis of the lever of hemoglobin gene mRNA and hemoglobin chain in peripheral blood
Zou Yi,Du Chuanshu,Zeng Ruiping,et al.
(Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089)
【Abstract】Objective To investigate the regulation of the expression of hemoglobin gene.Methods By using α-globin gene mRNA and α-globin chain as inner control,the lever of β mRNA and γ mRNA,β-globin chain and γ-globin chain in both β-thalassemia patients and normal adults were measured by semi-quantitative RT-PCR and electrophoresis of globin chain.Results The deficiency β-hemoglobin and the increase of γ-hemoglobin were found in the peripheral blood of patients of β-thalassemia.There was negative correlation between these two genes products.Conclusion There is a reciprocal relationship between β and γ globin products both at transcriptional lever and at translational lever.
, 百拇医药
【Key words】β-thalassemia Hemoglobin β globin gene mRNA Electrophoresis
人类血红蛋白在个体发育的不同阶段的变化和更替受到三个开头机制的控制，任何一个环节的调节机制失调或珠蛋白基因本身的缺陷都将导致血红蛋白合成的异常。β地中海贫血(简称地贫)患者外周血中β珠蛋白链的减少是患者一系列临床表现的病理基础。我们目前对血红蛋白转换和表达的调控知之甚少。但近年来发现的位于类β珠蛋白基因簇上游的位点控制区(LCR)及一系列的转录因子和反式作用因子均与类β珠蛋白表达的调控血红蛋白的开头机制有关。为了进一步揭示类β珠蛋白表达的规律，本文应用半定量RT-PCR和血红蛋白肽链电泳，以αmRNA和α珠蛋白肽链为内对照，检测并分析了在β地贫患者中类β珠蛋白基因表达的规律。
1 资料与方法
1.1 对象 受检者β地贫患者外周血由本校附属第一、第二、第三医院儿科提供，均为初诊患者或前次输血3个月以上的患者，正常对照来自本室工作人员和自愿者。
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1.2 外周血总RNA的提取 AGPC一步法。
1.3 珠蛋白mRNA相对含量的测定[1] 经RT-PCR，以α，β，γ mRNA特异的3对引物共扩增，引物序列见表1。
表1 α,β,γ珠蛋白基因扩增的特异性引物序列及其在DNA上的位置 位置
引物序列
(5′-3′)
扩增片段
长度(bp)
复性温度
(℃)
α nt56-79
, 百拇医药
GACAAGACCAACGTCAAGGCCGCC
372
56
nt 666-686
CAGGAACTTGTCCAGGGAGGC
β nt62153-62176
CAACTGTGTTCACTAGCAACCTCA
422
56
nt 63533-63556
TGTGGCTGCACTGGTGGGGTGAA
, 百拇医药
γ nt 34480-34500
ACTCGCTTCTGGAACGTCTGA
489
56
nt35836-35976
GTATCTGGAGGACAGGGCACT
反应体系：4 μl cDNA样品，5 μl反应缓冲液，50 pmol/L引物，5 μl dNTP(2 mmol/L)，Taq聚合酶(2 μ/μl)1 μl混匀，反应总体积50 μl，PCR循环条件为94℃变性1.5 min，56℃退火2 min，72℃延伸1.5 min，共28个循环，以保证PCR产物与模板含量成正比，3对引物分别扩增出372 bp的α片段，422 bp的β片段，489 bp的γ片段。PCR产物以6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染后，以扩增出的α片段为内对照，经薄层色谱仪扫描，计算β和γ珠蛋白mRNA的相对含量。
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1.4 血红蛋白溶液的制备 肝素抗凝外周血1 ml，生理盐水洗涤后，弃上层血清，剩余红细胞加入等体积H2O振荡，加入0.5体积的CCL4振荡，离心，取上层水相为血红蛋白溶液。
1.5 血红蛋白肽链电泳[2，3] 5～10 μg血红蛋白与25 μl加样变性液(1 ml含8 mmol/L尿素，10%冰醋酸，10%β-疏基乙醇，0.4 mg pyronin y)混合，12%(60∶0.4)尿素聚丙烯酰胺凝胶8.5 mA恒流电泳19 h，电流结束后以考马斯亮蓝染色，薄层色谱仪扫描定量，以α珠蛋白链为内对照，计算β和γ珠蛋白链的相对含量。
2 结果
2.1 27名重型地贫患者外周血珠蛋白基因mRNA相对含量测定结果 见表2。将27例患者β/α mRNA与γ/α mRNA两比值进行相关性分析(见图1)，相关系数=-0.6，双侧检验P<0.01(α=0.01)，分析认为β mRNA水平与γ mRNA水平存在线性负相关。
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表2 27名地贫患者外周血珠蛋白基因mRNA相对含量 样本
例数
β mRNA/α mRNA
γ mRNA/α mRNA
正常成人
10
1.02±0.8
0.05±0.03
β-地贫患者
27
0.39±0.28
1.1±0.43
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图1 27例β地贫患者β/α mRNA与γ/α mRNA相关性分析
2.2 血红蛋白肽链分析 正常人可见到α，β珠蛋白链两条泳带和泳动最慢的碳酸酐酶形成的泳带，β地贫患者可见到另有由于HbF增高形成的Gr和Ar珠蛋白泳带，而β珠蛋白含量减少(见图2)。29例β地贫患者外周血血红蛋白肽链检测结果如表3。将29例患者血红蛋白肽链(β/α)与(Gr/Ar)/α比值进行相关性分析(见图3)，相关系数P=-0.7，双侧检验P<0.01(α=0.01)，分析认为β珠蛋白肽链水平与γ珠蛋白肽链水平存在线性负相关。
表3 正常人和β地贫患者外周血血红蛋白肽链分析 样本
例数
β/α
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(Gr/Ar)α
正常人
10
1.09±0.05
0.02±0.01
β地贫患者
29
0.44±0.32
0.30±0.28
图2 血红蛋白肽链尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳
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图3 29例患者血红蛋白肽链(β/α)与(Gr/Ar)/α比值相关性分析
3 讨论
人类珠蛋白基因的缺失或缺陷导致珠蛋白分子结构或合成量的异常。β珠蛋白基因缺失或缺陷使β珠蛋白链合成受抑制，导致非α珠蛋白与α珠蛋白合成失衡，从而引起一系列临床症状。本文检测了27例β地贫患者α，β，γ珠蛋白基因mRNA相对表达量和29例β地贫患者珠蛋白肽链的相对含量，反映出在β地贫患者中，β珠蛋白减少或完全不能合成是由于β珠蛋白基因从转录到翻译各个环节的异常，而γ珠蛋白mRNA和肽链的增加，说明在出生后被关闭的γ珠蛋白基因是可以重新被激活的。
近年来红系特异增强子位点控制区LCR的发现和研究为人们提高对类β珠蛋白基因簇表达调控的认识提供了新线索。尽管人们对LCR的作用机制尚未了解清楚，但人们对血红蛋白开头机制提出一个总的模型[4，6]，即LCR通过与α，γ或β珠蛋白基因的相互作用来决定究竟哪一个基因被激活，而不能激活的基因通过诸如阻遏因子之类的蛋白因子结合保持静止状态。分析β地贫患者β与γ珠蛋白基因mRNA水平的相关性和β与γ珠蛋白肽链水平的相关性，发现两者均存在负相关，说明随着β珠蛋白基因产物的减少，γ珠蛋白基因产物相应升高，可能是因为β珠蛋白基因启动子的缺陷(如-28突变)使其与LCR作用减弱，从而增加了γ珠蛋白基因启动子与LCR作用的机会，也可能是因为β珠蛋白基因的缺陷，使其与某些转录因子和调节蛋白的合成，使得γ珠蛋白基因产物增加。证实从β和γ珠蛋白基因在转录和翻译水平都存在竞争性反馈的调节机制，从而为进一步研究类β珠蛋白基因表达的调控提供了基础。
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本课题受广东省科委、华南生命科学技术研究中心重大项目基金资助(96-427)
参考文献
1，黄淑帧.应用RT-PCR诊断地中海贫血综合征.中华血液学杂志，1994，15(4)：183
2，Alter BP.Globin chain electrophoresis:a new approach and to studies of globin synthesis.Br J Hematd,1980,44:527
3，Rovera G.Resolution of hemoglobin subunits by electrophoresis in acid urea polyacrylamide gels containing Triton X-100.Analytical Biochemistry,1988,85:506
, 百拇医药
4，Li Qi.Hypersensitive site 5 of the human beta locus control region functions as a chromatin insulator.Blood,1994,84:1399
5，Ronald SW.Lethal thalassemia after insertional disruption of the mouse major adult β-globin gene.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:3171
6，Frempong KO,Whitley KS.Use of hydroxyurea in children with sickle cell disease:what comes next? Semin Haematol,1997,24:30
(收稿日期：2000-05-29), 百拇医药
单位：(中山医科大学遗传教研室 510089)
关键词：β地中海贫血；珠蛋白肽链；β珠蛋白mRNA；血红蛋白电泳
广东医学001008
【摘要】目的 研究β地中海贫血(简称地贫)患者外周血中α,β,γ珠蛋白基因mRNA和肽链的相对含量，为进一步研究珠蛋白基因表达的调控提供基础。方法 应用半定量RT-PCR和血红蛋白电泳，以α珠蛋白基因mRNA和α珠蛋白链为内对照，检测了正常人和β地贫患者外周血中β和γ珠蛋白基因和肽链的相对含量。结果 β地贫患者外周血中β珠蛋白基因mRNA和β珠蛋白肽链都有不同程度的减少和γ珠蛋白基因产物代偿性增高，同时两者水平呈负相关。结论 β和γ珠蛋白基因在转录和翻译水平都存在竞争性反馈调节机制，随着β珠蛋白基因产物的减少γ珠蛋白基因产物相应升高。
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Determination and correlation analysis of the lever of hemoglobin gene mRNA and hemoglobin chain in peripheral blood
Zou Yi,Du Chuanshu,Zeng Ruiping,et al.
(Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089)
【Abstract】Objective To investigate the regulation of the expression of hemoglobin gene.Methods By using α-globin gene mRNA and α-globin chain as inner control,the lever of β mRNA and γ mRNA,β-globin chain and γ-globin chain in both β-thalassemia patients and normal adults were measured by semi-quantitative RT-PCR and electrophoresis of globin chain.Results The deficiency β-hemoglobin and the increase of γ-hemoglobin were found in the peripheral blood of patients of β-thalassemia.There was negative correlation between these two genes products.Conclusion There is a reciprocal relationship between β and γ globin products both at transcriptional lever and at translational lever.
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【Key words】β-thalassemia Hemoglobin β globin gene mRNA Electrophoresis
人类血红蛋白在个体发育的不同阶段的变化和更替受到三个开头机制的控制，任何一个环节的调节机制失调或珠蛋白基因本身的缺陷都将导致血红蛋白合成的异常。β地中海贫血(简称地贫)患者外周血中β珠蛋白链的减少是患者一系列临床表现的病理基础。我们目前对血红蛋白转换和表达的调控知之甚少。但近年来发现的位于类β珠蛋白基因簇上游的位点控制区(LCR)及一系列的转录因子和反式作用因子均与类β珠蛋白表达的调控血红蛋白的开头机制有关。为了进一步揭示类β珠蛋白表达的规律，本文应用半定量RT-PCR和血红蛋白肽链电泳，以αmRNA和α珠蛋白肽链为内对照，检测并分析了在β地贫患者中类β珠蛋白基因表达的规律。
1 资料与方法
1.1 对象 受检者β地贫患者外周血由本校附属第一、第二、第三医院儿科提供，均为初诊患者或前次输血3个月以上的患者，正常对照来自本室工作人员和自愿者。
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1.2 外周血总RNA的提取 AGPC一步法。
1.3 珠蛋白mRNA相对含量的测定[1] 经RT-PCR，以α，β，γ mRNA特异的3对引物共扩增，引物序列见表1。
表1 α,β,γ珠蛋白基因扩增的特异性引物序列及其在DNA上的位置 位置
引物序列
(5′-3′)
扩增片段
长度(bp)
复性温度
(℃)
α nt56-79
, 百拇医药
GACAAGACCAACGTCAAGGCCGCC
372
56
nt 666-686
CAGGAACTTGTCCAGGGAGGC
β nt62153-62176
CAACTGTGTTCACTAGCAACCTCA
422
56
nt 63533-63556
TGTGGCTGCACTGGTGGGGTGAA
, 百拇医药
γ nt 34480-34500
ACTCGCTTCTGGAACGTCTGA
489
56
nt35836-35976
GTATCTGGAGGACAGGGCACT
反应体系：4 μl cDNA样品，5 μl反应缓冲液，50 pmol/L引物，5 μl dNTP(2 mmol/L)，Taq聚合酶(2 μ/μl)1 μl混匀，反应总体积50 μl，PCR循环条件为94℃变性1.5 min，56℃退火2 min，72℃延伸1.5 min，共28个循环，以保证PCR产物与模板含量成正比，3对引物分别扩增出372 bp的α片段，422 bp的β片段，489 bp的γ片段。PCR产物以6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染后，以扩增出的α片段为内对照，经薄层色谱仪扫描，计算β和γ珠蛋白mRNA的相对含量。
, http://www.100md.com
1.4 血红蛋白溶液的制备 肝素抗凝外周血1 ml，生理盐水洗涤后，弃上层血清，剩余红细胞加入等体积H2O振荡，加入0.5体积的CCL4振荡，离心，取上层水相为血红蛋白溶液。
1.5 血红蛋白肽链电泳[2，3] 5～10 μg血红蛋白与25 μl加样变性液(1 ml含8 mmol/L尿素，10%冰醋酸，10%β-疏基乙醇，0.4 mg pyronin y)混合，12%(60∶0.4)尿素聚丙烯酰胺凝胶8.5 mA恒流电泳19 h，电流结束后以考马斯亮蓝染色，薄层色谱仪扫描定量，以α珠蛋白链为内对照，计算β和γ珠蛋白链的相对含量。
2 结果
2.1 27名重型地贫患者外周血珠蛋白基因mRNA相对含量测定结果 见表2。将27例患者β/α mRNA与γ/α mRNA两比值进行相关性分析(见图1)，相关系数=-0.6，双侧检验P<0.01(α=0.01)，分析认为β mRNA水平与γ mRNA水平存在线性负相关。
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表2 27名地贫患者外周血珠蛋白基因mRNA相对含量 样本
例数
β mRNA/α mRNA
γ mRNA/α mRNA
正常成人
10
1.02±0.8
0.05±0.03
β-地贫患者
27
0.39±0.28
1.1±0.43
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图1 27例β地贫患者β/α mRNA与γ/α mRNA相关性分析
2.2 血红蛋白肽链分析 正常人可见到α，β珠蛋白链两条泳带和泳动最慢的碳酸酐酶形成的泳带，β地贫患者可见到另有由于HbF增高形成的Gr和Ar珠蛋白泳带，而β珠蛋白含量减少(见图2)。29例β地贫患者外周血血红蛋白肽链检测结果如表3。将29例患者血红蛋白肽链(β/α)与(Gr/Ar)/α比值进行相关性分析(见图3)，相关系数P=-0.7，双侧检验P<0.01(α=0.01)，分析认为β珠蛋白肽链水平与γ珠蛋白肽链水平存在线性负相关。
表3 正常人和β地贫患者外周血血红蛋白肽链分析 样本
例数
β/α
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(Gr/Ar)α
正常人
10
1.09±0.05
0.02±0.01
β地贫患者
29
0.44±0.32
0.30±0.28
图2 血红蛋白肽链尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳
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图3 29例患者血红蛋白肽链(β/α)与(Gr/Ar)/α比值相关性分析
3 讨论
人类珠蛋白基因的缺失或缺陷导致珠蛋白分子结构或合成量的异常。β珠蛋白基因缺失或缺陷使β珠蛋白链合成受抑制，导致非α珠蛋白与α珠蛋白合成失衡，从而引起一系列临床症状。本文检测了27例β地贫患者α，β，γ珠蛋白基因mRNA相对表达量和29例β地贫患者珠蛋白肽链的相对含量，反映出在β地贫患者中，β珠蛋白减少或完全不能合成是由于β珠蛋白基因从转录到翻译各个环节的异常，而γ珠蛋白mRNA和肽链的增加，说明在出生后被关闭的γ珠蛋白基因是可以重新被激活的。
近年来红系特异增强子位点控制区LCR的发现和研究为人们提高对类β珠蛋白基因簇表达调控的认识提供了新线索。尽管人们对LCR的作用机制尚未了解清楚，但人们对血红蛋白开头机制提出一个总的模型[4，6]，即LCR通过与α，γ或β珠蛋白基因的相互作用来决定究竟哪一个基因被激活，而不能激活的基因通过诸如阻遏因子之类的蛋白因子结合保持静止状态。分析β地贫患者β与γ珠蛋白基因mRNA水平的相关性和β与γ珠蛋白肽链水平的相关性，发现两者均存在负相关，说明随着β珠蛋白基因产物的减少，γ珠蛋白基因产物相应升高，可能是因为β珠蛋白基因启动子的缺陷(如-28突变)使其与LCR作用减弱，从而增加了γ珠蛋白基因启动子与LCR作用的机会，也可能是因为β珠蛋白基因的缺陷，使其与某些转录因子和调节蛋白的合成，使得γ珠蛋白基因产物增加。证实从β和γ珠蛋白基因在转录和翻译水平都存在竞争性反馈的调节机制，从而为进一步研究类β珠蛋白基因表达的调控提供了基础。
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本课题受广东省科委、华南生命科学技术研究中心重大项目基金资助(96-427)
参考文献
1，黄淑帧.应用RT-PCR诊断地中海贫血综合征.中华血液学杂志，1994，15(4)：183
2，Alter BP.Globin chain electrophoresis:a new approach and to studies of globin synthesis.Br J Hematd,1980,44:527
3，Rovera G.Resolution of hemoglobin subunits by electrophoresis in acid urea polyacrylamide gels containing Triton X-100.Analytical Biochemistry,1988,85:506
, 百拇医药
4，Li Qi.Hypersensitive site 5 of the human beta locus control region functions as a chromatin insulator.Blood,1994,84:1399
5，Ronald SW.Lethal thalassemia after insertional disruption of the mouse major adult β-globin gene.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:3171
6，Frempong KO,Whitley KS.Use of hydroxyurea in children with sickle cell disease:what comes next? Semin Haematol,1997,24:30
(收稿日期：2000-05-29), 百拇医药