白细胞介素10对儿童慢性淋巴细胞性甲状腺炎γ干扰素/白细胞介素4失衡的影响
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作者：董文斌 肖大成 冉隆瑞 唐章华
单位：董文斌 肖大成 冉隆瑞 唐章华(646000 四川省泸州医学院附属医院儿科)
关键词：甲状腺炎；自身免疫性；白细胞介素10；白细胞介素4；干扰素Ⅱ型
中华儿科杂志000211 【摘要】 目的 探讨白细胞介素10 (IL-10)对慢性淋巴细胞性甲状腺炎(CLT)γ-干扰素(IFN-γ)/IL-4水平失衡的影响。方法 采用酶联免疫吸附法，对加入基因重组IL-10处理前后10例CLT患儿外周血单个核细胞(PBMC)诱生IFN-γ和IL-4水平的变化进行观察。结果 患儿PBMC产生IFN-γ为(3 081±1 823)ng/L，IL-4为(289±32)ng/L ，IFN-γ/IL-4比值为10.1±5.4；对照组IFN-γ为(1 506 ±578)ng/L，IL-4为(382±104)ng/L，IFN-γ/IL-4比值为5.0±3.1，两组比较差异有显著意义(t=2.61、3.56、2.61，P<0.05、0.01、0.05)。加入终浓度为20 μg/L的重组人白细胞介素10(rhIL-10)后, IFN-γ为(1 831 ±1 562)ng/L，IL-4为(381±125)ng/L，与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论IL-10可抑制Th1类细胞因子IFN-γ的产生，诱导Th2类细胞因子IL-4的升高,从而使CLT患儿失衡的细胞因子水平趋于正常。
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The effect of rhIL-10 on the imbalance of IFN-γ/IL-4 in children with chronic lymphocytic thyroiditis
DONG Wenbin XIAO Dacheng RAN Longrui et al.
Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Luzhou Medical College, Sichuan 646000，China
【Abstract】 Objective To explore the effect of IL-10 on the imbalance of IFN-γ/IL-4 in children with chronic lymphocytic thyroiditis. Methods The levels of IFN-γ, IL-4 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) before and after receiving recombinant interleukin-10 stimulation were determined by using ELISA in 10 children with chronic lymphocytic thyroiditis (CLT). Results The levels of IFN-γ [(3 081±1 823)ng/L] and the ratio of IFN-γ/IL-4 10.1±5.4 increased (P<0.05) and IL-4 [(289± 32)ng/L] decreased (P<0.01) in children with CLT as compared with controls [(1 506 ± 578)ng/L, 5.0±3.1, (382±104)ng/L]. The increased IFN-γ and declined IL-4 were reversed by rhIL-10 (20 μg/L) to(1 831±1 562)ng/L and(381±125)ng/L , which were not significantly different from those of controls (P>0.05). Conclusion IL-10 could redress the imbalance of Th1/Th2 type cytokine by inhibiting the synthesis of Th1 type cytokine and inducing the production of Th2 type cytokine.
, 百拇医药
【Key words】 Thyroiditis, autoimmune; Interleukin-10; Interleukin-4; Interferon type Ⅱ
慢性淋巴细胞性甲状腺炎(chronic lymphocytic thyroiditis,CLT),又称桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis,HT),属自身免疫性疾病,是碘供应充分地区小儿弥漫性甲状腺肿和获得性甲状腺功能减退最常见的原因[1]。研究表明:细胞因子在其免疫调节紊乱和病理过程中起着关键作用[2,3]。有研究证实:该病体内存在Th1/Th2类细胞因子的失衡,表现为Th1类因子亢进[γ-干扰素(IFN-γ)水平升高]占优势,且细胞因子失衡与其发病密切相关[3]。白细胞介素10(IL-10)作为Th2类细胞因子的一种,可使鼠甲状腺球蛋白激发T细胞增殖反应和细胞毒性反应减弱[4]。本研究进一步观察基因重组的IL-10(rhIL-10)对CLT患儿Th1/Th2类细胞因子失衡的影响。
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对象和方法
一、研究对象
1.患儿组:初诊的10例CLT,男性3例,女性7例,年龄7～13岁,平均9.8岁,临床表现和实验室检查均符合其诊断标准：甲状腺球蛋白抗体大于30%和(或)过氧化物酶抗体大于15%均判为阳性[1]。
2.正常对照组:正常儿童10例,均为健康体检儿童,经过询问病史、体检及必要的实验室检查,排除了心、肝、肾及免疫性疾病,性别和年龄与疾病组相匹配。
上述受试对象在取血前1月内无明显感染史,无血制品及免疫增强剂或免疫抑制剂等用药史。
二、实验方法
1.PBMC培养上清液的制备： 自患儿肘静脉抽取无菌静脉血2 ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品,比重1.077±0.002),密度梯度离心20 min(2 000 r/min),吸取单个核细胞(PBMC),以PBS液洗3次,0.2%台盼蓝实验鉴定细胞活力在95%以上,用含10%小牛血清的RPMI-1640液将细胞浓度配成1×109 /L,在24孔培养板孔内分3组进行。
, 百拇医药
2.分组：⑴ A组(+RPMI-1640组):取患儿细胞悬液1 ml,加入植物血凝素(广州医药工业研究所产品,终浓度为100 ng/L)、脂多糖(北京邦定公司提供，终浓度为2 ng/L)和20 μl 的含10%灭活小牛血清RPMI-1640液,然后在37℃,5%CO2条件下培养72 h,离心无菌收集上清液,在-30℃保存,待测细胞因子。⑵ B组(+rhIL-10组):取患儿细胞悬液1ml,加入含rhIL-10(深圳晶美生物工程公司提供)的10%灭活小牛血清RPMI-1640液20 μl(IL-10终浓度为20 μg/L)，其余条件均同A组。⑶ C组(正常对照组):取正常儿童细胞悬液1 ml,加入 含10%灭活的小牛血清RPMI-1640液20 μl,其余条件均同A组。
3.检测指标：⑴ 上清液INF-γ水平的测定：ABC-ELISA法,试剂盒购自第二军医大学微生物学教研室,严格按照说明书操作,在450型酶联仪(Bio-Rad产品)测得吸光度(A)值后，根据标准浓度制定标准曲线,然后在标准曲线上查找相应的值,单位为ng/L。⑵ 上清液IL-4水平:双抗体夹心ELISA法,试剂盒购自深圳晶美生物工程公司。
, 百拇医药
三、统计学方法
结果用均数±标准差表示,需统计的指标均输入Primer软件,在计算机上统计,进行正态性检验和方差齐性检验,用两样本均数比较的或配对t(t′)检验分析差异显著性。检验水准α=0.05。
结果
与对照组相比,患儿PBMC在植物血凝素和脂多糖刺激下IFN-γ、IFN-γ/IL-4比值明显增高(P<0.05),IL-4水平明显降低(P<0.01);加入终浓度为20 μg/L的rhIL-10后,可使升高的IFN-γ水平降低，降低的IL-4水平明显升高,使与对照组差异无显著意义(P>0.05)(表1)。
表1 rhIL-10对CLT患儿细胞因子水平的影响(
±s) 组别
, 百拇医药
例数
IFN-γ
(ng/L)
IL-4
(ng/L)
IFN-γ
/IL-4
A
10
3 081±1 823
289± 32
10.1±5.4
B
, 百拇医药
10
1 831±1 562
381±125
4.0±1.9
C
10
1 506± 578
382±104
5.0±3.1
t值
A与B比较△
3.10*
, 百拇医药
3.03*
2.89*
A与C比较#
2.61*
3.56**
2.61*
B与C比较#
0.62
0.002
0.88
注：A:+RPMI-1640组, B:+rhIL-10组, C:正常对照组；△ 配对 t检验,# t′检验; * P<0.05, ** P<0.01讨论
, 百拇医药
自身免疫性疾病的发生与Th1/Th2类细胞因子的失衡密切相关,通过调节Th1/Th2细胞亚群比例,进而纠正失衡的细胞因子来治疗自身免疫性疾病是当今该领域研究的热点[5]。本研究采用重组的人IL-10,在细胞水平观察对CLT患儿Th1/Th2类细胞因子水平失衡的影响,结果显示:它能使亢进的Th1类细胞因子(IFN-γ)和下降的Th2类细胞因子(IL-4)水平恢复到正常水平。这与国外有关IL-10的同类研究结果[6,7]相似。
IL-10是一种分子量为35 000～40 000的酸敏感蛋白,可由Th2细胞、B细胞、巨噬细胞产生,可通过作用于抗原递呈细胞或诱导一种尚不知的次级因子来改变细胞内信号的传递途径,实现对一些细胞因子(Th2类)的诱生作用,而对另外的因子(Th1类)具有抑制作用。有研究表明:IL-10能抑制T细胞活性和细胞因子产生,特别是炎症前细胞因子如IFN-γ、肿瘤坏死因子α等[6,7]。正常情况下,作为Th2类细胞因子,通过抑制过多的Th1类细胞因子的合成和诱导Th2类细胞因子的产生,对于维持Th1/Th2类因子的平衡起重要作用[8]。
, 百拇医药
本研究选用最适抑制浓度的IL-10,能使CLT患儿失衡的细胞因子恢复到正常水平,不仅证实了本病体内IL-10水平低下在其细胞因子失衡中的作用,而且为在临床上将rhIL-10用于CLT的治疗提供了一定的理论和实验依据。但IL-10是否在基因水平来纠正细胞因子失衡尚需进一步研究。
参考文献
[1]杜永昌，鲍秀兰，王慧敏，等.抗甲状腺抗体测定在儿童和青少年甲状腺中的应用，中华儿科杂志，1987，25：336-338.
[2]Del Prete GF,Tiri A,Mariotti S, et al. Enhanced production of gamma-interferon by thyroid-derived T cell clones from patients with Hashimoto′s thyroiditis. Clin Exp Immunol,1987,69:323-331.
, 百拇医药
[3]Loebenstein GB，Buchan G， Chantry D，et al. Analysis of intrathyroidal cytokine production in thyroid autoimmune disease: thyroid follicular cells produce interleukin-1α and interleukin-6.Clin Exp Immunol,1989,77：324-330.
[4]Godefroy MK，Rott O，Brazillet MP，et al.Curative and protective effects of IL-10 in experimental autoimmune thyroiditis(EAT).J Immunol,1995,154:634-643.
[5]王前奔,赵武述.Th细胞亚群在自身免疫病的发病及治疗中作用的实验研究进展.生理科学进展,1997,28:119-124.
, 百拇医药
[6]Fiorentino DF,Zlotnik A,Mosmann TR,et al.IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages.J Immunol,1991,147:3815.
[7]D'Andrea AM,Aste-Amezaga M,Valiante NM,et al.Interleukin 10(IL-10) inhibits human lymhocyte interferon-gamma production by suppressing nature killer cell stimulatory factor/IL-12 synthesis in accessory cells.J Exp Med,1993,178:1041-1049.
[8]Constant SL, Bottomly K. Induction of Th1 and Th2 CD+4 T cell response: the alternative approaches. Ann Rev Immunol, 1997,15:297-322.
收稿日期：1999-01-22, 百拇医药
单位：董文斌 肖大成 冉隆瑞 唐章华(646000 四川省泸州医学院附属医院儿科)
关键词：甲状腺炎；自身免疫性；白细胞介素10；白细胞介素4；干扰素Ⅱ型
中华儿科杂志000211 【摘要】 目的 探讨白细胞介素10 (IL-10)对慢性淋巴细胞性甲状腺炎(CLT)γ-干扰素(IFN-γ)/IL-4水平失衡的影响。方法 采用酶联免疫吸附法，对加入基因重组IL-10处理前后10例CLT患儿外周血单个核细胞(PBMC)诱生IFN-γ和IL-4水平的变化进行观察。结果 患儿PBMC产生IFN-γ为(3 081±1 823)ng/L，IL-4为(289±32)ng/L ，IFN-γ/IL-4比值为10.1±5.4；对照组IFN-γ为(1 506 ±578)ng/L，IL-4为(382±104)ng/L，IFN-γ/IL-4比值为5.0±3.1，两组比较差异有显著意义(t=2.61、3.56、2.61，P<0.05、0.01、0.05)。加入终浓度为20 μg/L的重组人白细胞介素10(rhIL-10)后, IFN-γ为(1 831 ±1 562)ng/L，IL-4为(381±125)ng/L，与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论IL-10可抑制Th1类细胞因子IFN-γ的产生，诱导Th2类细胞因子IL-4的升高,从而使CLT患儿失衡的细胞因子水平趋于正常。
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The effect of rhIL-10 on the imbalance of IFN-γ/IL-4 in children with chronic lymphocytic thyroiditis
DONG Wenbin XIAO Dacheng RAN Longrui et al.
Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Luzhou Medical College, Sichuan 646000，China
【Abstract】 Objective To explore the effect of IL-10 on the imbalance of IFN-γ/IL-4 in children with chronic lymphocytic thyroiditis. Methods The levels of IFN-γ, IL-4 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) before and after receiving recombinant interleukin-10 stimulation were determined by using ELISA in 10 children with chronic lymphocytic thyroiditis (CLT). Results The levels of IFN-γ [(3 081±1 823)ng/L] and the ratio of IFN-γ/IL-4 10.1±5.4 increased (P<0.05) and IL-4 [(289± 32)ng/L] decreased (P<0.01) in children with CLT as compared with controls [(1 506 ± 578)ng/L, 5.0±3.1, (382±104)ng/L]. The increased IFN-γ and declined IL-4 were reversed by rhIL-10 (20 μg/L) to(1 831±1 562)ng/L and(381±125)ng/L , which were not significantly different from those of controls (P>0.05). Conclusion IL-10 could redress the imbalance of Th1/Th2 type cytokine by inhibiting the synthesis of Th1 type cytokine and inducing the production of Th2 type cytokine.
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【Key words】 Thyroiditis, autoimmune; Interleukin-10; Interleukin-4; Interferon type Ⅱ
慢性淋巴细胞性甲状腺炎(chronic lymphocytic thyroiditis,CLT),又称桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis,HT),属自身免疫性疾病,是碘供应充分地区小儿弥漫性甲状腺肿和获得性甲状腺功能减退最常见的原因[1]。研究表明:细胞因子在其免疫调节紊乱和病理过程中起着关键作用[2,3]。有研究证实:该病体内存在Th1/Th2类细胞因子的失衡,表现为Th1类因子亢进[γ-干扰素(IFN-γ)水平升高]占优势,且细胞因子失衡与其发病密切相关[3]。白细胞介素10(IL-10)作为Th2类细胞因子的一种,可使鼠甲状腺球蛋白激发T细胞增殖反应和细胞毒性反应减弱[4]。本研究进一步观察基因重组的IL-10(rhIL-10)对CLT患儿Th1/Th2类细胞因子失衡的影响。
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对象和方法
一、研究对象
1.患儿组:初诊的10例CLT,男性3例,女性7例,年龄7～13岁,平均9.8岁,临床表现和实验室检查均符合其诊断标准：甲状腺球蛋白抗体大于30%和(或)过氧化物酶抗体大于15%均判为阳性[1]。
2.正常对照组:正常儿童10例,均为健康体检儿童,经过询问病史、体检及必要的实验室检查,排除了心、肝、肾及免疫性疾病,性别和年龄与疾病组相匹配。
上述受试对象在取血前1月内无明显感染史,无血制品及免疫增强剂或免疫抑制剂等用药史。
二、实验方法
1.PBMC培养上清液的制备： 自患儿肘静脉抽取无菌静脉血2 ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品,比重1.077±0.002),密度梯度离心20 min(2 000 r/min),吸取单个核细胞(PBMC),以PBS液洗3次,0.2%台盼蓝实验鉴定细胞活力在95%以上,用含10%小牛血清的RPMI-1640液将细胞浓度配成1×109 /L,在24孔培养板孔内分3组进行。
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2.分组：⑴ A组(+RPMI-1640组):取患儿细胞悬液1 ml,加入植物血凝素(广州医药工业研究所产品,终浓度为100 ng/L)、脂多糖(北京邦定公司提供，终浓度为2 ng/L)和20 μl 的含10%灭活小牛血清RPMI-1640液,然后在37℃,5%CO2条件下培养72 h,离心无菌收集上清液,在-30℃保存,待测细胞因子。⑵ B组(+rhIL-10组):取患儿细胞悬液1ml,加入含rhIL-10(深圳晶美生物工程公司提供)的10%灭活小牛血清RPMI-1640液20 μl(IL-10终浓度为20 μg/L)，其余条件均同A组。⑶ C组(正常对照组):取正常儿童细胞悬液1 ml,加入 含10%灭活的小牛血清RPMI-1640液20 μl,其余条件均同A组。
3.检测指标：⑴ 上清液INF-γ水平的测定：ABC-ELISA法,试剂盒购自第二军医大学微生物学教研室,严格按照说明书操作,在450型酶联仪(Bio-Rad产品)测得吸光度(A)值后，根据标准浓度制定标准曲线,然后在标准曲线上查找相应的值,单位为ng/L。⑵ 上清液IL-4水平:双抗体夹心ELISA法,试剂盒购自深圳晶美生物工程公司。
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三、统计学方法
结果用均数±标准差表示,需统计的指标均输入Primer软件,在计算机上统计,进行正态性检验和方差齐性检验,用两样本均数比较的或配对t(t′)检验分析差异显著性。检验水准α=0.05。
结果
与对照组相比,患儿PBMC在植物血凝素和脂多糖刺激下IFN-γ、IFN-γ/IL-4比值明显增高(P<0.05),IL-4水平明显降低(P<0.01);加入终浓度为20 μg/L的rhIL-10后,可使升高的IFN-γ水平降低，降低的IL-4水平明显升高,使与对照组差异无显著意义(P>0.05)(表1)。
表1 rhIL-10对CLT患儿细胞因子水平的影响(
±s) 组别, 百拇医药
例数
IFN-γ
(ng/L)
IL-4
(ng/L)
IFN-γ
/IL-4
A
10
3 081±1 823
289± 32
10.1±5.4
B
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10
1 831±1 562
381±125
4.0±1.9
C
10
1 506± 578
382±104
5.0±3.1
t值
A与B比较△
3.10*
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3.03*
2.89*
A与C比较#
2.61*
3.56**
2.61*
B与C比较#
0.62
0.002
0.88
注：A:+RPMI-1640组, B:+rhIL-10组, C:正常对照组；△ 配对 t检验,# t′检验; * P<0.05, ** P<0.01讨论
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自身免疫性疾病的发生与Th1/Th2类细胞因子的失衡密切相关,通过调节Th1/Th2细胞亚群比例,进而纠正失衡的细胞因子来治疗自身免疫性疾病是当今该领域研究的热点[5]。本研究采用重组的人IL-10,在细胞水平观察对CLT患儿Th1/Th2类细胞因子水平失衡的影响,结果显示:它能使亢进的Th1类细胞因子(IFN-γ)和下降的Th2类细胞因子(IL-4)水平恢复到正常水平。这与国外有关IL-10的同类研究结果[6,7]相似。
IL-10是一种分子量为35 000～40 000的酸敏感蛋白,可由Th2细胞、B细胞、巨噬细胞产生,可通过作用于抗原递呈细胞或诱导一种尚不知的次级因子来改变细胞内信号的传递途径,实现对一些细胞因子(Th2类)的诱生作用,而对另外的因子(Th1类)具有抑制作用。有研究表明:IL-10能抑制T细胞活性和细胞因子产生,特别是炎症前细胞因子如IFN-γ、肿瘤坏死因子α等[6,7]。正常情况下,作为Th2类细胞因子,通过抑制过多的Th1类细胞因子的合成和诱导Th2类细胞因子的产生,对于维持Th1/Th2类因子的平衡起重要作用[8]。
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本研究选用最适抑制浓度的IL-10,能使CLT患儿失衡的细胞因子恢复到正常水平,不仅证实了本病体内IL-10水平低下在其细胞因子失衡中的作用,而且为在临床上将rhIL-10用于CLT的治疗提供了一定的理论和实验依据。但IL-10是否在基因水平来纠正细胞因子失衡尚需进一步研究。
参考文献
[1]杜永昌，鲍秀兰，王慧敏，等.抗甲状腺抗体测定在儿童和青少年甲状腺中的应用，中华儿科杂志，1987，25：336-338.
[2]Del Prete GF,Tiri A,Mariotti S, et al. Enhanced production of gamma-interferon by thyroid-derived T cell clones from patients with Hashimoto′s thyroiditis. Clin Exp Immunol,1987,69:323-331.
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[3]Loebenstein GB，Buchan G， Chantry D，et al. Analysis of intrathyroidal cytokine production in thyroid autoimmune disease: thyroid follicular cells produce interleukin-1α and interleukin-6.Clin Exp Immunol,1989,77：324-330.
[4]Godefroy MK，Rott O，Brazillet MP，et al.Curative and protective effects of IL-10 in experimental autoimmune thyroiditis(EAT).J Immunol,1995,154:634-643.
[5]王前奔,赵武述.Th细胞亚群在自身免疫病的发病及治疗中作用的实验研究进展.生理科学进展,1997,28:119-124.
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[6]Fiorentino DF,Zlotnik A,Mosmann TR,et al.IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages.J Immunol,1991,147:3815.
[7]D'Andrea AM,Aste-Amezaga M,Valiante NM,et al.Interleukin 10(IL-10) inhibits human lymhocyte interferon-gamma production by suppressing nature killer cell stimulatory factor/IL-12 synthesis in accessory cells.J Exp Med,1993,178:1041-1049.
[8]Constant SL, Bottomly K. Induction of Th1 and Th2 CD+4 T cell response: the alternative approaches. Ann Rev Immunol, 1997,15:297-322.
收稿日期：1999-01-22, 百拇医药