HDV/HBV感染树鼩肝组织中Bcl2/Bax表达及其在肝细胞凋亡中的作用
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作者：蒋业贵 李奇芬 王宇明 顾长海
单位：第三军医大学西南医院全军传染病中心 重庆，400038
关键词：
中华内科杂志000722 目前已有许多实验研究表明Bax 可促进细胞凋亡，Bcl2 可抑制细胞凋亡[1]。本研究以HDV/HBV感染树为研究对象，采用免疫组化技术检测树肝组织中HDAg、Bcl2和Bax表达；采用TUNEL法原位检测肝细胞凋亡，并应用连续切片和双重染色分析丁型肝炎病毒抗原和Bcl2/Bax表达以及其与肝细胞凋亡的关系。
一、材料与方法
1.标本来源：所有标本取自我科采用HDV/HBV同时和重叠感染的8 只经血清和肝组织检测HDV标志物阳性、伴ALT升高的树，选取感染后4～10周肝组织标本(每周取肝组织1次)共45份，每份标本组作连续切片进行系列检测。
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2.检测方法： HDAg、Bcl2/Bax检测采用SP法，HDAg多克隆抗体由本室用HDAg合成肽免疫家兔制备而成。兔抗Bax多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,鼠抗Bcl2单克隆抗体购自美国Maxim公司。免疫组化双重染色试剂盒购自美国Zymed公司，分别作Bcl2/Bax 、HDAg/Bax、 Bax/细胞凋亡、HDAg/细胞凋亡双重染色。原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司，以反应混合液不加TdT作为阴性对照。
3.对照组： 阴性对照用3例未经HDV感染的正常树肝组织，经免疫组化证实肝炎病毒标志物均阴性。阳性对照为预实验中HDAg、Bax和Bcl2阳性树肝组织，此外分别用兔血清和PBS代替第一抗体，以确定其特异性和可靠性。
4.阳性程度分级： 阳性程度分为3级： 低倍镜视野阳性细胞分于1/3为(+)，1/3～2/3为(++)，大于2/3为(+++)。
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5.统计学处理：采用计数资料的χ2检验，两两比较采用行X列表χ2检验的分割方法。
二、结果
1.肝组织中HDAg、 Bcl2/Bax检测：所检测的45份标本中，39份可检出HDAg,阳性率86.7%；33份可检出Bax,阳性率为73.3%；7份可检出Bcl2,阳性率为15.6%。免疫组化染色结果见图1，2。
2.肝细胞凋亡检测：45份标本中，41份可检出凋亡阳性细胞，凋亡检出率为91.1%,TUNEL检测结果见图3。
3.HDAg表达与Bcl2/Bax表达的关系：见表1，图4。
表1 肝细胞Bcl2/Bax表达与HDAg表达的关系 HDAg
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表达
Bcl2表达*
Bax表达**
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注：*χ2=27.6,P<0.005; **χ2=35.9,P<0.005
4.Bcl2/Bax、 HDAg表达与肝细胞凋亡的关系：见表2 ，图5，6。
表2 肝细胞Bcl2/Bax表达与肝细胞凋亡的关系 凋亡检测
Bcl2表达*
Bax表达**
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注：*χ2=40.1,P<0.005; **χ2=38.2， P<0.005
讨论 本研究发现HDV/HBV感染树肝组织中有Bax大量表达,Bcl2 仅有少量表达。HDAg表达越强，Bax表达也越强， 相反Bcl2表达则越弱，与文献报道的HBsAg与Bcl2/Bax之间的关系相似[2，3]，提示HDV感染及其活动复制可诱导Bax 表达，但对Bcl2表达无明显诱导作用。我们在研究中还发现，Bax和Bcl2可在同一区域同一细胞中表达，推测其意义可能为：当Bax过多表达时，Bax与Bcl2形成同源二聚体，促进细胞凋亡[4]。
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肝细胞凋亡是病毒性肝炎较常见的病理改变，凋亡在HDAg阳性和阴性细胞中均可发生，但以在HDAg阳性细胞中发生为主，说明凋亡可发生在病毒感染和未感染的肝细胞中。有学者研究发现，许多病毒如EB病毒、腺病毒等可抑制宿主细胞凋亡使其更有效地复制，HDV是否也有此种效应有待进一步研究。
Bax表达越强，凋亡阳性细胞越多，Bcl2表达越强，凋亡阳性细胞越少，经统计学处理两者有显著的关联性(P<0.005)。连续切片和双重染色发现，凋亡的肝细胞多为Bax表达阳性，绝大数Bcl2表达阳性的细胞TUNEL试验都为阴性。以上研究说明Bax表达可促进细胞凋亡，Bcl2表达可抑制细胞凋亡。
HBV与HDV之间存在相互影响，故HDV感染肝组织中Bcl2/Bax表达以及肝细胞凋亡可能受HBV影响，所得出的结论可能是HDV和HBV共同作用的结果。至于HBV与HDV在肝细胞凋亡方面相互影响的确切机制，目前还不太清楚，需进一步研究。
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图1 HDV/HBV 感染树鼠句肝组织中 378 表达 SP×400
图2 HDV/HBV感染树鼠句肝组织中Bcl2表达 ×400
图4 HDV/HBV感染树鼠句肝组织中Bax和HDAg 表达Bax(紫红色，AEC显色)和HDAg(紫黑色，NBT 显色)可在同一区域或同一细胞中表达 双重染色 ×1000
图3 凋亡阳性细胞在 DV/HBV感染树鼠句肝组织中呈散在分布TUNEL×400
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图5 HDV/HBV感染树鼠句 肝组织中凋亡和HDAg表达，凋亡(紫黑色，NBT 显色)在 HDAg(紫红色，AEC显色)阳性细胞中发生为主 双重染色 ×1000
图6 HDV/HBV感染树鼠句肝组织中凋亡和Bax表达，凋亡(紫黑色，NBT 显色)在 HDAg(紫红色， AEC显色)阳性细胞中发生为主 双重染色 ×1000
参考文献
1，Popper C,Hoy T,Bentley DP.Bcl2/Bax ratios in chronic lymphocytic leukaemia and their correlation with in vitro apoptosis and clinical resistance.Br J Cancer,1997,76:935-938.
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2，郭琳琅，曹长安.Bcl2及相关蛋白Bax在慢性乙型肝炎肝组织中的表达.中华肝脏病杂志，1997,5：210-211.
3，郎振为，王海舰，孟析，等.病毒性肝炎患者肝组织中Bcl2蛋白的表达.中华肝脏病杂志，1998,6：85-87.
4，Knudson CM,Korsmeyer SJ.Bcl2 and Bax function independently to regulated cell death.Nat Genet,1997,16:358-363.
收稿日期：1999-10-14, 百拇医药
单位：第三军医大学西南医院全军传染病中心 重庆，400038
关键词：
中华内科杂志000722 目前已有许多实验研究表明Bax 可促进细胞凋亡，Bcl2 可抑制细胞凋亡[1]。本研究以HDV/HBV感染树为研究对象，采用免疫组化技术检测树肝组织中HDAg、Bcl2和Bax表达；采用TUNEL法原位检测肝细胞凋亡，并应用连续切片和双重染色分析丁型肝炎病毒抗原和Bcl2/Bax表达以及其与肝细胞凋亡的关系。
一、材料与方法
1.标本来源：所有标本取自我科采用HDV/HBV同时和重叠感染的8 只经血清和肝组织检测HDV标志物阳性、伴ALT升高的树，选取感染后4～10周肝组织标本(每周取肝组织1次)共45份，每份标本组作连续切片进行系列检测。
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2.检测方法： HDAg、Bcl2/Bax检测采用SP法，HDAg多克隆抗体由本室用HDAg合成肽免疫家兔制备而成。兔抗Bax多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,鼠抗Bcl2单克隆抗体购自美国Maxim公司。免疫组化双重染色试剂盒购自美国Zymed公司，分别作Bcl2/Bax 、HDAg/Bax、 Bax/细胞凋亡、HDAg/细胞凋亡双重染色。原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司，以反应混合液不加TdT作为阴性对照。
3.对照组： 阴性对照用3例未经HDV感染的正常树肝组织，经免疫组化证实肝炎病毒标志物均阴性。阳性对照为预实验中HDAg、Bax和Bcl2阳性树肝组织，此外分别用兔血清和PBS代替第一抗体，以确定其特异性和可靠性。
4.阳性程度分级： 阳性程度分为3级： 低倍镜视野阳性细胞分于1/3为(+)，1/3～2/3为(++)，大于2/3为(+++)。
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5.统计学处理：采用计数资料的χ2检验，两两比较采用行X列表χ2检验的分割方法。
二、结果
1.肝组织中HDAg、 Bcl2/Bax检测：所检测的45份标本中，39份可检出HDAg,阳性率86.7%；33份可检出Bax,阳性率为73.3%；7份可检出Bcl2,阳性率为15.6%。免疫组化染色结果见图1，2。
2.肝细胞凋亡检测：45份标本中，41份可检出凋亡阳性细胞，凋亡检出率为91.1%,TUNEL检测结果见图3。
3.HDAg表达与Bcl2/Bax表达的关系：见表1，图4。
表1 肝细胞Bcl2/Bax表达与HDAg表达的关系 HDAg
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注：*χ2=27.6,P<0.005; **χ2=35.9,P<0.005
4.Bcl2/Bax、 HDAg表达与肝细胞凋亡的关系：见表2 ，图5，6。
表2 肝细胞Bcl2/Bax表达与肝细胞凋亡的关系 凋亡检测
Bcl2表达*
Bax表达**
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注：*χ2=40.1,P<0.005; **χ2=38.2， P<0.005
讨论 本研究发现HDV/HBV感染树肝组织中有Bax大量表达,Bcl2 仅有少量表达。HDAg表达越强，Bax表达也越强， 相反Bcl2表达则越弱，与文献报道的HBsAg与Bcl2/Bax之间的关系相似[2，3]，提示HDV感染及其活动复制可诱导Bax 表达，但对Bcl2表达无明显诱导作用。我们在研究中还发现，Bax和Bcl2可在同一区域同一细胞中表达，推测其意义可能为：当Bax过多表达时，Bax与Bcl2形成同源二聚体，促进细胞凋亡[4]。
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肝细胞凋亡是病毒性肝炎较常见的病理改变，凋亡在HDAg阳性和阴性细胞中均可发生，但以在HDAg阳性细胞中发生为主，说明凋亡可发生在病毒感染和未感染的肝细胞中。有学者研究发现，许多病毒如EB病毒、腺病毒等可抑制宿主细胞凋亡使其更有效地复制，HDV是否也有此种效应有待进一步研究。
Bax表达越强，凋亡阳性细胞越多，Bcl2表达越强，凋亡阳性细胞越少，经统计学处理两者有显著的关联性(P<0.005)。连续切片和双重染色发现，凋亡的肝细胞多为Bax表达阳性，绝大数Bcl2表达阳性的细胞TUNEL试验都为阴性。以上研究说明Bax表达可促进细胞凋亡，Bcl2表达可抑制细胞凋亡。
HBV与HDV之间存在相互影响，故HDV感染肝组织中Bcl2/Bax表达以及肝细胞凋亡可能受HBV影响，所得出的结论可能是HDV和HBV共同作用的结果。至于HBV与HDV在肝细胞凋亡方面相互影响的确切机制，目前还不太清楚，需进一步研究。
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图1 HDV/HBV 感染树鼠句肝组织中 378 表达 SP×400
图2 HDV/HBV感染树鼠句肝组织中Bcl2表达 ×400
图4 HDV/HBV感染树鼠句肝组织中Bax和HDAg 表达Bax(紫红色，AEC显色)和HDAg(紫黑色，NBT 显色)可在同一区域或同一细胞中表达 双重染色 ×1000
图3 凋亡阳性细胞在 DV/HBV感染树鼠句肝组织中呈散在分布TUNEL×400
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图5 HDV/HBV感染树鼠句 肝组织中凋亡和HDAg表达，凋亡(紫黑色，NBT 显色)在 HDAg(紫红色，AEC显色)阳性细胞中发生为主 双重染色 ×1000
图6 HDV/HBV感染树鼠句肝组织中凋亡和Bax表达，凋亡(紫黑色，NBT 显色)在 HDAg(紫红色， AEC显色)阳性细胞中发生为主 双重染色 ×1000
参考文献
1，Popper C,Hoy T,Bentley DP.Bcl2/Bax ratios in chronic lymphocytic leukaemia and their correlation with in vitro apoptosis and clinical resistance.Br J Cancer,1997,76:935-938.
, 百拇医药
2，郭琳琅，曹长安.Bcl2及相关蛋白Bax在慢性乙型肝炎肝组织中的表达.中华肝脏病杂志，1997,5：210-211.
3，郎振为，王海舰，孟析，等.病毒性肝炎患者肝组织中Bcl2蛋白的表达.中华肝脏病杂志，1998,6：85-87.
4，Knudson CM,Korsmeyer SJ.Bcl2 and Bax function independently to regulated cell death.Nat Genet,1997,16:358-363.
收稿日期：1999-10-14, 百拇医药