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编号:10291832
肝细胞癌组织和癌周组织中p53基因密码子249突变的比较研究
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     作者:彭晓谋,彭文伟,姚春斓,陈雪娟

    单位:

    关键词:肝肿瘤;p53基因;突变

    癌症990511 【摘 要】 目的:本研究通过比较研究HCC癌组织和癌周组织中p53基因密码子249特征性突变来进一步阐明该基因在HCC发生机制中的意义。方法:收集9份癌组织中经单链构型多态性分析研究证实存在密码子249突变的HCC标本和11例无此突变的HCC标本,采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)方法比较研究癌组织和癌周组织中密码子249突变情况。结果:20例HCC中,癌周组织中密码子249特征性突变检出率为70%。9例SSCP阳性者的癌周组织中的特征性突变检出率达100%。11例阴性患者的癌组织和癌周组织也能检出一定水平的突变。结论:p53基因密码子249突变在非癌肝组织中广泛存在。癌组织中密码了249特征性突变可能发生在肿瘤形成之前。
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    中图分类号:R735.7;R730.231 文献标识码:A 文章编号:1000-467X(1999)05-0526-03

    Comparison of codon 249 mutations of p53 gene in cancerous tissues with that in pericancerous tissues of HCCs

    PENG Xiao-mou, PENG Wen-wei, YAO Chun-lan,et al.

    Viral Hepatitis Laboratory,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510630,P.R. China

    【Abstract】 Objective:To analyze codon 249 mutation of p53 gene in cancerous tissue and pericancerous tissue of HCC comparatively,and study the significance of p53 gene in hepatocarcinogenesis. Methods:Codon 249 mutations were detected using allele-specific PCR in cancerous and pericancerous tissues of 9 codon 249 mutation positive cases and 11 negative cases detected by single-stranded conformational polymorphism (SSCP) analysis in former research. Results:The detective rate of codon 249 mutation in pericancerous tissues was 70% (14/20). That in 9 cases of SSCP positive HCCs was 100% (9/9).Codon 249 mutations were also detected in cancerous and pericancerous tissues of 11 SSCP negative HCCs.Conclusions:Codon 249 mutations of p53 gene were very popular in non-neoplastic tissues.Those mutations in cancerous tissues might take place in the stage before the formation of tumor.
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    Key words:Hepatoma;p53 gene;Mutation

    45%~60%南部非洲和中国启东肝细胞癌(HCC)的p53基因携带一个特征性突变,即密码子249的第三个碱基发生G→T突变〔1,2〕。这使得p53基因在HCC发生机制中的意义显得特别重要〔3~5〕。然而,一些学者报道这种突变仅见于晚期或分化较差的HCC〔6,7〕,对其是否参与HCC发生机制中的启动过程持有争议。争论的焦点是特征性突变发生的时间。过去,基因突变一般采用单链构象多态性分析(SSCP)或限制酶片长度多态性分析等进行检测。这些方法只能在已形成的肿瘤中检测出p53基因的突变。最近有人应用敏感的等位基因特异性PCR(AS-PCR)技术,可从非癌肝组织中检出密码子249突变〔8〕,提示p53基因的突变可能出现在肿瘤形成之前。本研究收集传统方法证实突变阳性的HCC9例和突变阴性HCC11例,并分成癌组织和癌周组织进行比较研究,进一步探讨癌组织中p53基因特征性突变发生的时间。
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    1 材料

    20例HCC患者手术切除标本的癌组织和癌周组织收集于中山医科大学附属肿瘤医院。全部标本分成2份分别进行RNA和DNA提取。RNA提取采用一步酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法进行。基因组DNA采用蛋白酶K消化-酚-氯仿抽提法提取。细胞总RNA和基因组DNA于-70℃保存。20份HCC标本中9例经SSCP分析证实癌组织中存在密码子249特征性突变〔3〕

    2 方法

    2.1 AS-PCR在DNA水平检测密码子249特征性突变

    以基因组DNA为模板,先采用引物5’-GGCGACAGAGCGAGATTCCA-3’(S2,引物在p53基因上的相对位置见图1)和5’-GATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’(A2)进行初步扩增,再采用另一对引物5’-TGGGCGGCATGAACCGGAGT-3’(S3,等位基因特异引物,其3’端为密码子249,最后一碱基G设计为T)或5’-TGGGCGGCATGAACCGGAGG-3’(S4)和5’-GGGTCAGCGGCAAGCAGAGG-3’(A1)进行第二次扩增。PCR的条件同报道〔3〕。阳性者PCR产物为121bp。
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    图1 引物在p53基因上的相对位置和扩增产物覆盖区域

    2.2 AS-PCR在RNA水平检测密码子249特征性突变

    以细胞总RNA为模板,先用引物5’-GTGCAGCTGTGGGTTGATTC-3’(S1)和5’-GTTGGGCAGTGCTCGCTTAG-3’(A3)在AMV逆转录酶的作用,于42℃进行逆转录,并进行第一次扩增,然后再采用等位基因特异引物(S3)或S4和5’-GATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’(A2)引物进行第二次扩增。阳性者产物为138bp。

    3 结果

    3.1 DNA水平检测密码子249特征性突变

    AS-PCR检测密码子249特征性突变的产物分析见图2。所有标本均被引物S3或S4,或两者同时扩增出条带。且碱基数与设计相符。20例HCC患者中密码子249特征性突变检出情况见表1。与SSCP分析比较见表2。
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    图2 AS-PCR在DNA水平检测密码子249突变时的电泳分析

    1为GIBcoBRL公司的100bpIadder;2,4,5为阳性;3为阴性

    表1 癌组织和非癌组织中密码子249突变情况 组 别

    例数

    等位基因特异性PCR

    DNA(%)

    RNA(%)

    癌周组织

    20

    70

    70
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    癌组织

    20

    65

    70

    表2 SSCP阳性和阴性患者p53基因密码子249突变的比较 组 别

    例 数

    组织类型

    DNA(%)

    RNA(%)

    SSCP阳性

    9

    癌组织

, http://www.100md.com     100**

    88.9

    癌周组织

    100*

    88.9

    SSCP阴性

    11

    癌组织

    36.4

    54.5

    癌周组织

    45.5

    54.5
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    *与SSCP阴性相应组比较,χ2检验,P<0.05,**P< 0.01

    3.2 RNA水平检测密码子249特征性突变

    采用AS-RT-PCR能成功地扩增所有组织标本中的目的片段。且碱基数与设计相符,见图3。20例HCC患者中密码子249特征性突变检出情况见表1。与SSCP分析比较见表2。

    4 讨论

    p53基因特征性突变是发生在肿瘤形成前,还是形成后是确定p53基因在HCC发病机制中意义的关键。采用AS-PCR技术初步检测发现,在HCC高发区,6份非癌肝组织中5例能检出密码子249特征性,而9份来自低发区的标本则未能检出突变〔8〕。本研究显示,20例HCC癌周组织中密码子249的突变率达70%,提示在非癌肝组织中密码子249特征性突变是较普遍的现象,HCC癌组织中的这种突变可能发生在肿瘤形成之前。进一步采用比较的方法研究癌组织和癌周组织中密码子249的突变情况发现,9例SSCP证实密码子249突变阳性HCC的癌周组织中100%检出突变,表明癌组织中密码子249突变不是独立事件。进一步支持密码子249特征性突变是发生在肿瘤形成之前的观点。
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    图3 AS-PCR在RNA水平检测密码子249

    突变时的电泳分析

    4为GIBcoBRL公司的100bpIadder;1,2,5为

    阳性;3为阴性

    RNA水平研究结果与DNA水平高度一致,表明非癌肝组织中突变的p53基因是活跃表达的,提示具有一定的功能。然而,11例SSCP阴性HCC的癌组织和癌周组织中,采用AS-PCR均能检出一定水平的突变,提示在中国南部HCC肿瘤组织