梅毒螺旋体抗体吸收试验(ETA-ABS-IgG)的建立
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作者：任 翊 何 君 黄 策 刘德恭
单位：任翊 刘德恭 100054北京佑安医院北京市性病防治所；何君 黄策军事医学科学院五所一室
关键词：
中华皮肤科杂志990325 随着免疫组化技术的建立和成熟，用酶标抗体代替荧光抗体，就能用普通光学显微镜读结果。我们依据免疫组化的理论，按FTA-ABS试验的原理建立了ETA-ABS-IgG试验，使梅毒螺旋体抗原染成棕黄色(DAB显色)或红色(AEC显色)，阳性标本在普通显微镜下清晰易辨。此外我们还用236例性病门诊患者血清平行配对做ETAABSIgG试验及TPPA、RPR试验，现将ETAABSIgG试验的步骤及实验结果报道如下。
一、材料与方法
(一)材料：
, 百拇医药
1.病例选择：病例样本取自北京市性病防治所1997～1998年门诊患者血清共236份，56℃30min灭活补体后-20℃冷冻备存。样本中男159例、女77例。按卫生部疾病控制司梅毒诊断标准[1]，临床排除梅毒的108例，临床诊断梅毒的128例，其中一期梅毒40例，未治疗33例，治疗7例；二期梅毒56例，未治疗27例，治疗29例；早期潜伏梅毒18例，未治疗12例，治疗6例；病期不详的14例。年龄(31.56±7.12)岁。
2.试剂：FTAABS试剂盒、Nichols标准梅毒螺旋体毒株抗原片，螺旋体Reiter株培养液吸收剂，均由军事医学科学院五所一室提供。生物素标记羊抗人IgG(22506)，HRP-链霉亲和素(D1030、F0811)，封片剂Clearmount以及封闭用正常羊血清均购自北京中山公司。TPPA试剂盒为日本富士产(VN80602)，RPR试剂盒为新疆新地公司产。
3.自配试剂：PBS(pH7.4,0.01mol/L)，醋酸缓冲液(pH5.2,0.15mol/L),封闭剂(10%正常羊血清的PBS)，样本稀释剂(1%BSA，10%正常羊血清，0.02%吐温20的PBS)，清洗剂(含0.08%吐温20的PBS)，酶稀释剂(1%BSA，10%正常羊血清，0.04%吐温20)，DAB(DAB2.5mg,10mLPBS,0.1mL3%过氧化氢)，AEC(4mgAEC，1mL二甲基甲酰胺，14mL醋酸缓冲液，0.15mL3%过氧化氢)。
, 百拇医药
(二)方法：
把梅毒螺旋体Nichols标准毒株兔睾丸接种培养，离心获梅毒螺旋体作为抗原固定于载玻片上。用已灭活血清和样本稀释剂1∶20稀释，再与吸收剂1∶1混合使最终样本稀释度为1∶40，然后37℃20min孵育，以去除交叉抗体。与此同时抗TP抗原片加20μL封闭剂37℃20min，以封闭空白位点。将已吸收的血清20μL加在抗原片上，37℃30min湿盒孵育，使TPIgG抗体与抗原结合。用清洗液浸泡清洗5min2次，期间提插抗原片数次，以洗去未结合的抗体。把1∶400稀释的生物素化羊抗人IgG抗体20μL加在抗原片上，37℃20min，使其与抗TPIgG抗体结合。重复浸泡清洗5min2次。加1∶100稀释的HRP-链亲和素20μL，37℃20min，浸泡清洗8min2次。最后加底物DAB/AEC，结合上的HRP使DAB氧化呈棕黄色，AEC呈红色。AEC显色后需用封片剂Clearmount封片。
TPPA及RPR均按试剂盒说明的步骤进行。ETAABSIgG试验的判断结果为：阳性标准：光镜下(×400)可见染成棕黄色或红色的梅毒螺旋体，油镜下(×1000)可见梅毒螺旋体呈细丝状，两头尖，中间有排列均匀螺旋的典型形态；阴性标准：油镜下(×1000)未发现染色的梅毒螺旋体；可疑标准为：DAB染色中，高倍镜下(×400)可见染成棕黄色的螺旋体，但油镜下(×1000)螺旋体形态不清晰。由于DAB显色呈棕黄色，当血清中抗TP抗体滴度低到一定水平，DAB显色浅，结果与某些显微镜的黄光背景不易区分，所以先用DAB染色，对其中可疑病例再用AEC染色确定。
, 百拇医药
本研究用北京市性病防治所1997～1998年门诊患者血清236份，平行配对由两人分别做ETAABSIgG及TPPA、RPR，数据用SPSS软件作配对χ2检验。
二、结果
用我们建立的ETABASIgG试验的方法检测血清中抗TPIgG抗体，阳性结果十分清晰易辨，在油镜下(×1000)可以清楚地看见TP的典型形态。对236例样本的配对检测结果见表1、2。
表1 236份血清平行配对检测TPPA和ETAABSIgG试验的结果比较
ETA-ABS-IgG试验与TPPA试验检测
合计
χ2值
, 百拇医药
+
-
TPPA试验+
125
3
128
0.125
-
5
103
108
P>0.05
合计
, http://www.100md.com
130
106
236
表2 236份血清平行配对检测RPR和ETA-ABS-IgG试验的结果比较
ETA-ABS-IgG试验与TPPA试验检测
合计
χ2值
+
-
RPR试验+
102
0
, http://www.100md.com
102
26.036
-
28
106
134
P<0.01
合计
130
106
236
表3 ETA-ABS-IgG试验与RPR试验对各期梅毒的敏感性
临床分期
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例数(n)
ETA-ABS试验(%)
RPR试验(%)
一期梅毒
40
未治疗
33
100
75.8
治疗
7
100
71.4
, 百拇医药
二期梅毒
56
未治疗
27
100
100
治疗
29
96.6
79.3
早期潜伏
18
未治疗
, 百拇医药
12
100
83.3
治疗
6
83.3
50.0
病期不详
14
92.9
64.3
合计
128
, http://www.100md.com
97.6
79.7
本文所用缩写：ETA-ABS-IgG：梅毒螺旋体抗体吸收试验，FTA-ABS：荧光螺旋体抗体吸收试验，TPPA：梅毒螺旋体乳胶凝集试验，RPR：快速血浆反应素试验，PBS：磷酸缓冲液，HRP：辣根过氧化物酶，DAB：二氨基联苯胺，BSA：牛血清白蛋白PA试验相比ETA-ABS-IgG试验的特异性为95.3%，敏感性为97.6%。其中TPPA阳性但ETA-ABSIgG阴性的3份血清，推测是由于标本中TP特异性抗体浓度太低所致，当样本稀释度升高到1：10～1：20时这3份血清ETA-ABS-IgG试验结果均呈现阳性。另外TPPA阴性而ETAABSIgG阳性的5份血清，考虑是由于非特异性染色所致，由于TP抗原片中不可避免地有兔蛋白污染，而且TP有吸附蛋白的特性，虽经封闭羊抗人IgG抗体仍有可能与兔蛋白结合造成假阳性。而ETAABSIgG试验与RPR试验统计学上差异有显著性，它与RPR对各期梅毒的敏感性见表3。
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本次实验中，ETAABSIgG试验对治疗后二期梅毒的敏感性为96.6%，小于一期梅毒和未治疗二期梅毒的100%。理论上抗TPIgG抗体一旦形成可维持终身，但临床上发现随着及时的有效治疗和病程的延长，抗TPIgG抗体的血清滴度可逐渐下降，有些可下降到现有试剂盒不能检测的水平，所以本实验中ETAABSIgG试验对二期梅毒的敏感性低于一期梅毒。抗TPIgG抗体滴度的下降，也可从ETAABSIgG试验对治疗后早期潜伏梅毒的敏感性仅为83.3%看出。
三、讨论
目前虽然各国之间梅毒流行的情况差别很大，但梅毒依旧是十分重要的社会和医学问题[2]，而梅毒的防治关键在于早期诊断，所以梅毒的早期、特异、敏感、简便并且易于推广的检测方法仍是当前研究的热点。对此，国外已利用人工合成梅毒抗原(Tpp15，Tpp17和Tpp47)设计出各种快速诊断试剂盒，如SyphilisFast[3]和ICESyphilisEIA[4]，其敏感性、特异性分别达93%、99.8%和99%、99.8%，而国内在合成梅毒抗原之前，对现有实验方法进行改良，提高早期梅毒的检出率亦有临床意义，所以我们用免疫组化技术对FTAABS试验进行改良，建立了ETAABSIgG试验，使之能在普通显微镜下读结果，并且利用不同底物产生的不同显色效果，不仅结果清晰易辨，而且通过相互参照，可以最大程度地减少主观差异，提高对试验结果可疑病例判断的准确性。
, 百拇医药
ETA-ABS-IgG试验作为梅毒血清学检测方法的一种，它的敏感性为97.6%，特异性为95.3%，与TPPA试验相比统计学上无显著性差异，可替代TPPA试验作为梅毒血清学诊断的确认试验，而且ETA-ABS法可在不增加设备的前提下，检测抗TPIgM抗体，以及对硬下疳压片进行免疫染色检验梅毒螺旋体，从而提高梅毒的早期诊断率，所以ETAABS法更具有临床应用价值。而RPR试验在本次实验中对于二期未治疗的梅毒敏感性尚高，但由于反应素一般在硬下疳出现后4周才阳转，经有效抗梅治疗后滴度迅速下降，所以RPR试验对于一期梅毒和已治疗梅毒的敏感性低于80%。在临床中一期梅毒和经过各种抗生素治疗的梅毒却最为常见，所以非梅毒螺旋体抗原试验作为初筛试验越来越不能满足临床早期诊断的需要，必须推广梅毒螺旋体抗原试验以提高检出率。作为梅毒螺旋体抗原试验的一种，ETAABSIgG试验对一期梅毒和未治疗的二期梅毒、早期潜伏梅毒的敏感性达100%，高于RPR试验的敏感性，并且与RPR试验统计学上有显著性差异，所以从提高梅毒检出率的角度，ETAABSIgG试验优于RPR试验，有利于梅毒的早期诊断。
, 百拇医药
对于底物的选择，DAB与AEC各有利弊。DAB产物稳定，无须封片即可在油镜下读结果，但DAB有致癌性，黄褐色产物不易与某些显微镜的黄光背景相区分；AEC产物呈红色，在黄光和蓝光背景中很醒目，但其产物十分不稳定，易溶于酒精和油类制剂，在油镜下读结果必须封片。总之，ETAABSIgG试验克服了FTAABS试验必须依赖荧光显微镜的弊端，但广泛临床应用需更大的样本检验该方法。
参考文献
1 卫生部防疫司.性病防治手册.第2版.南京：江苏科学技术出版社，1994.9-12.
2 Drusin LM . Syphilis makes a comeback. Int J STD AIDS, 1996,7:7- 9.
3 Young H, Moyes A, De Ste Croix I, et al. A new recombinant antigen latex agglutination test (syphilis fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis. Int J STD AIDS, 1998,9:196- 200.
4 Young H, Moyes A, Seagar L, et al. Novel recombinant antigen enzyme immunoassay for serological diagnosis of syphilis. J Clin Microbiol, 1998,36:913- 917.
(收稿：1998-11-06修回：1999-01-25), 百拇医药
单位：任翊 刘德恭 100054北京佑安医院北京市性病防治所；何君 黄策军事医学科学院五所一室
关键词：
中华皮肤科杂志990325 随着免疫组化技术的建立和成熟，用酶标抗体代替荧光抗体，就能用普通光学显微镜读结果。我们依据免疫组化的理论，按FTA-ABS试验的原理建立了ETA-ABS-IgG试验，使梅毒螺旋体抗原染成棕黄色(DAB显色)或红色(AEC显色)，阳性标本在普通显微镜下清晰易辨。此外我们还用236例性病门诊患者血清平行配对做ETAABSIgG试验及TPPA、RPR试验，现将ETAABSIgG试验的步骤及实验结果报道如下。
一、材料与方法
(一)材料：
, 百拇医药
1.病例选择：病例样本取自北京市性病防治所1997～1998年门诊患者血清共236份，56℃30min灭活补体后-20℃冷冻备存。样本中男159例、女77例。按卫生部疾病控制司梅毒诊断标准[1]，临床排除梅毒的108例，临床诊断梅毒的128例，其中一期梅毒40例，未治疗33例，治疗7例；二期梅毒56例，未治疗27例，治疗29例；早期潜伏梅毒18例，未治疗12例，治疗6例；病期不详的14例。年龄(31.56±7.12)岁。
2.试剂：FTAABS试剂盒、Nichols标准梅毒螺旋体毒株抗原片，螺旋体Reiter株培养液吸收剂，均由军事医学科学院五所一室提供。生物素标记羊抗人IgG(22506)，HRP-链霉亲和素(D1030、F0811)，封片剂Clearmount以及封闭用正常羊血清均购自北京中山公司。TPPA试剂盒为日本富士产(VN80602)，RPR试剂盒为新疆新地公司产。
3.自配试剂：PBS(pH7.4,0.01mol/L)，醋酸缓冲液(pH5.2,0.15mol/L),封闭剂(10%正常羊血清的PBS)，样本稀释剂(1%BSA，10%正常羊血清，0.02%吐温20的PBS)，清洗剂(含0.08%吐温20的PBS)，酶稀释剂(1%BSA，10%正常羊血清，0.04%吐温20)，DAB(DAB2.5mg,10mLPBS,0.1mL3%过氧化氢)，AEC(4mgAEC，1mL二甲基甲酰胺，14mL醋酸缓冲液，0.15mL3%过氧化氢)。
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(二)方法：
把梅毒螺旋体Nichols标准毒株兔睾丸接种培养，离心获梅毒螺旋体作为抗原固定于载玻片上。用已灭活血清和样本稀释剂1∶20稀释，再与吸收剂1∶1混合使最终样本稀释度为1∶40，然后37℃20min孵育，以去除交叉抗体。与此同时抗TP抗原片加20μL封闭剂37℃20min，以封闭空白位点。将已吸收的血清20μL加在抗原片上，37℃30min湿盒孵育，使TPIgG抗体与抗原结合。用清洗液浸泡清洗5min2次，期间提插抗原片数次，以洗去未结合的抗体。把1∶400稀释的生物素化羊抗人IgG抗体20μL加在抗原片上，37℃20min，使其与抗TPIgG抗体结合。重复浸泡清洗5min2次。加1∶100稀释的HRP-链亲和素20μL，37℃20min，浸泡清洗8min2次。最后加底物DAB/AEC，结合上的HRP使DAB氧化呈棕黄色，AEC呈红色。AEC显色后需用封片剂Clearmount封片。
TPPA及RPR均按试剂盒说明的步骤进行。ETAABSIgG试验的判断结果为：阳性标准：光镜下(×400)可见染成棕黄色或红色的梅毒螺旋体，油镜下(×1000)可见梅毒螺旋体呈细丝状，两头尖，中间有排列均匀螺旋的典型形态；阴性标准：油镜下(×1000)未发现染色的梅毒螺旋体；可疑标准为：DAB染色中，高倍镜下(×400)可见染成棕黄色的螺旋体，但油镜下(×1000)螺旋体形态不清晰。由于DAB显色呈棕黄色，当血清中抗TP抗体滴度低到一定水平，DAB显色浅，结果与某些显微镜的黄光背景不易区分，所以先用DAB染色，对其中可疑病例再用AEC染色确定。
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本研究用北京市性病防治所1997～1998年门诊患者血清236份，平行配对由两人分别做ETAABSIgG及TPPA、RPR，数据用SPSS软件作配对χ2检验。
二、结果
用我们建立的ETABASIgG试验的方法检测血清中抗TPIgG抗体，阳性结果十分清晰易辨，在油镜下(×1000)可以清楚地看见TP的典型形态。对236例样本的配对检测结果见表1、2。
表1 236份血清平行配对检测TPPA和ETAABSIgG试验的结果比较
ETA-ABS-IgG试验与TPPA试验检测
合计
χ2值
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+
-
TPPA试验+
125
3
128
0.125
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5
103
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合计
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130
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表2 236份血清平行配对检测RPR和ETA-ABS-IgG试验的结果比较
ETA-ABS-IgG试验与TPPA试验检测
合计
χ2值
+
-
RPR试验+
102
0
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26.036
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28
106
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合计
130
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表3 ETA-ABS-IgG试验与RPR试验对各期梅毒的敏感性
临床分期
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例数(n)
ETA-ABS试验(%)
RPR试验(%)
一期梅毒
40
未治疗
33
100
75.8
治疗
7
100
71.4
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二期梅毒
56
未治疗
27
100
100
治疗
29
96.6
79.3
早期潜伏
18
未治疗
, 百拇医药
12
100
83.3
治疗
6
83.3
50.0
病期不详
14
92.9
64.3
合计
128
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97.6
79.7
本文所用缩写：ETA-ABS-IgG：梅毒螺旋体抗体吸收试验，FTA-ABS：荧光螺旋体抗体吸收试验，TPPA：梅毒螺旋体乳胶凝集试验，RPR：快速血浆反应素试验，PBS：磷酸缓冲液，HRP：辣根过氧化物酶，DAB：二氨基联苯胺，BSA：牛血清白蛋白PA试验相比ETA-ABS-IgG试验的特异性为95.3%，敏感性为97.6%。其中TPPA阳性但ETA-ABSIgG阴性的3份血清，推测是由于标本中TP特异性抗体浓度太低所致，当样本稀释度升高到1：10～1：20时这3份血清ETA-ABS-IgG试验结果均呈现阳性。另外TPPA阴性而ETAABSIgG阳性的5份血清，考虑是由于非特异性染色所致，由于TP抗原片中不可避免地有兔蛋白污染，而且TP有吸附蛋白的特性，虽经封闭羊抗人IgG抗体仍有可能与兔蛋白结合造成假阳性。而ETAABSIgG试验与RPR试验统计学上差异有显著性，它与RPR对各期梅毒的敏感性见表3。
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本次实验中，ETAABSIgG试验对治疗后二期梅毒的敏感性为96.6%，小于一期梅毒和未治疗二期梅毒的100%。理论上抗TPIgG抗体一旦形成可维持终身，但临床上发现随着及时的有效治疗和病程的延长，抗TPIgG抗体的血清滴度可逐渐下降，有些可下降到现有试剂盒不能检测的水平，所以本实验中ETAABSIgG试验对二期梅毒的敏感性低于一期梅毒。抗TPIgG抗体滴度的下降，也可从ETAABSIgG试验对治疗后早期潜伏梅毒的敏感性仅为83.3%看出。
三、讨论
目前虽然各国之间梅毒流行的情况差别很大，但梅毒依旧是十分重要的社会和医学问题[2]，而梅毒的防治关键在于早期诊断，所以梅毒的早期、特异、敏感、简便并且易于推广的检测方法仍是当前研究的热点。对此，国外已利用人工合成梅毒抗原(Tpp15，Tpp17和Tpp47)设计出各种快速诊断试剂盒，如SyphilisFast[3]和ICESyphilisEIA[4]，其敏感性、特异性分别达93%、99.8%和99%、99.8%，而国内在合成梅毒抗原之前，对现有实验方法进行改良，提高早期梅毒的检出率亦有临床意义，所以我们用免疫组化技术对FTAABS试验进行改良，建立了ETAABSIgG试验，使之能在普通显微镜下读结果，并且利用不同底物产生的不同显色效果，不仅结果清晰易辨，而且通过相互参照，可以最大程度地减少主观差异，提高对试验结果可疑病例判断的准确性。
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ETA-ABS-IgG试验作为梅毒血清学检测方法的一种，它的敏感性为97.6%，特异性为95.3%，与TPPA试验相比统计学上无显著性差异，可替代TPPA试验作为梅毒血清学诊断的确认试验，而且ETA-ABS法可在不增加设备的前提下，检测抗TPIgM抗体，以及对硬下疳压片进行免疫染色检验梅毒螺旋体，从而提高梅毒的早期诊断率，所以ETAABS法更具有临床应用价值。而RPR试验在本次实验中对于二期未治疗的梅毒敏感性尚高，但由于反应素一般在硬下疳出现后4周才阳转，经有效抗梅治疗后滴度迅速下降，所以RPR试验对于一期梅毒和已治疗梅毒的敏感性低于80%。在临床中一期梅毒和经过各种抗生素治疗的梅毒却最为常见，所以非梅毒螺旋体抗原试验作为初筛试验越来越不能满足临床早期诊断的需要，必须推广梅毒螺旋体抗原试验以提高检出率。作为梅毒螺旋体抗原试验的一种，ETAABSIgG试验对一期梅毒和未治疗的二期梅毒、早期潜伏梅毒的敏感性达100%，高于RPR试验的敏感性，并且与RPR试验统计学上有显著性差异，所以从提高梅毒检出率的角度，ETAABSIgG试验优于RPR试验，有利于梅毒的早期诊断。
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对于底物的选择，DAB与AEC各有利弊。DAB产物稳定，无须封片即可在油镜下读结果，但DAB有致癌性，黄褐色产物不易与某些显微镜的黄光背景相区分；AEC产物呈红色，在黄光和蓝光背景中很醒目，但其产物十分不稳定，易溶于酒精和油类制剂，在油镜下读结果必须封片。总之，ETAABSIgG试验克服了FTAABS试验必须依赖荧光显微镜的弊端，但广泛临床应用需更大的样本检验该方法。
参考文献
1 卫生部防疫司.性病防治手册.第2版.南京：江苏科学技术出版社，1994.9-12.
2 Drusin LM . Syphilis makes a comeback. Int J STD AIDS, 1996,7:7- 9.
3 Young H, Moyes A, De Ste Croix I, et al. A new recombinant antigen latex agglutination test (syphilis fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis. Int J STD AIDS, 1998,9:196- 200.
4 Young H, Moyes A, Seagar L, et al. Novel recombinant antigen enzyme immunoassay for serological diagnosis of syphilis. J Clin Microbiol, 1998,36:913- 917.
(收稿：1998-11-06修回：1999-01-25), 百拇医药