梅毒螺旋体Tpp17基因的扩增、克隆及表达
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作者：熊礼宽 周华 宁波 洪福昌 曾序春 罗斌
单位：熊礼宽 周华 洪福昌 曾序春 罗斌(深圳市慢性病防治院性病防治中心)；宁波(中山医科大学免疫教研室)
关键词：
中华微生物学和免疫学杂志000605 梅毒螺旋体(Treponema pallidum subsp.pallidum，Tp)脂蛋白[相对分子质量(Mr)为17×103]是一种很强的免疫原，感染后1周内即可产生Mr为17×103的抗体〔1〕。因此，我们用PCR扩增Tp 17×103脂蛋白基因(Tpp17)，进行克隆，并对重组体pMAL-Tpp17进行了表达。
材料和方法
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主要试剂：PCR marker、蛋白质相对分子质量标准、λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ，购自华美生物工程公司；溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、十六烷基-三甲基溴化胺(CATB)、氨苄青霉素，购自Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)超纯、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K、苯*****(PMSF)，脱氧胆酸，DNA酶Ⅰ，溶菌酶，购自Merck公司；琼脂糖，Taq酶、dNTP、质粒提取试剂盒，购自Qiagene公司，XbaⅠ、E.coli Kl2-TBl，购自New Eng1and BioLab公司；限制性内切酶PstⅠ、T4 DNA ligase、琼脂糖酶和nitrocellulose膜，购自Gibco BRL公司; ExpandTM High Fidelity PCR System，购自Boehringer Mannheim公司；低熔点琼脂糖、二甲苯青，购自Pharmacia Biotech公司; 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-gal)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、N，N-二甲基甲酰胺，购自Amersco公司; 酵母提取物、胰蛋白胨、营养琼脂，购自Oxoid公司；氯化钙购自和光纯药株式会社；其它试剂均为国产分析纯。
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菌种和质粒：Tp(Nicho1s)，全国性病防治中心龚匡隆医生惠赠; LP(Leptospira)中山医科大微生物教研室惠赠。pMAL-C2购自New England BioLab公司。
TP和LP DNA提取：参照Isaacs等〔2〕介绍的方法。
引物：根据GeneBank发表的Tp 17×103外膜蛋白Tpp17基因序列，设计一对引物如下：引物1： 5′ GCGTCTAGAGTGATGAAAGGATCT 3′；引物2： 5′ CCC
TGCAGCAGACTTAACTATTT 3′； 由上海生工有限公司合成。
PCR扩增：引物l和引物2(1μg/μl)各5μl，2mmol/L dNTP 5μl, 10×PCR buffer 5μl, Tp DNA 6μl, expend Taq酶2.5U，无菌去离子水24μl, 反应条件：94℃ 5 min，94℃ 20 s，53℃ 30 s，72℃ 60 s，10个循环后，从11个循环开始，每循环1周，延伸时间延长5 s，至40个循环，最后72℃延伸10 min。
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PCR产物检测、Tpp17基因诱导表达、包涵体内表达产物检测：按《分子克隆实验指南》进行〔3〕。
PCR鉴定重组pMAL-C2/Tpp17质粒DNA：将5份重组质粒100℃煮沸10 min后，按Tpp17扩增条件扩增，电泳后观察结果。
Western b1ot分析：经SDS-PAGE后，转移至NC膜上，经1%脱脂牛奶封闭后，加入1∶100梅毒病人血清，室温摇荡60 min，洗涤后加入酶标羊抗人IgG，室温摇荡30 min，再洗涤后加入底物溶液，室温摇荡显色15 min后，加入2mol/L硫酸终止反应。20例梅毒病人血清，均经梅毒确诊试验(passiveparticle agglutination test，TPPA)证实，其滴度为1∶80～1∶1 280；5例活动性结核病病人血清和5例健康人血清均为本实验室保藏。
结果和讨论
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1.Tp染色体DNA提取：将提取的Tp染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察点样孔一边缘有1条清晰的带。
2.PCR扩增目的基因：Tppl7基因序列已经阐明，从起始密码子到第165位碱基是编码成熟17×103的信号肽序列，从第166位碱基到第567位碱基是编码成熟Tp17×103序列〔4，5〕。我们根据所要获取Tppl7全基因序列，分别设计了5′和3′端引物序列，扩增481bp。我们在两引物的5′端分别设计了限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ的酶切位点，以便于扩增Tpp17基因定向克隆于相应的酶切载体上。此外，在限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ的酶切位点分别引入了3和2个保护性碱基，以利于酶切反应。实际扩增的PCR产物电泳30 min后，在302nm紫外灯下观察，显示约500bp处有一清晰整齐的条带，无拖尾、弥散。实验结果证明了引物设计正确。扩增Tpp17基因一方面为克隆表达打下了基础，另一方面，由于Tpp17基因片段短，也可用于临床诊断。此外，本实验扩增的Tpp17基因分别有3个和4个AluⅢ和HaeⅠ内切酶位点，可用于限制性片段长度多态性分析研究〔6〕，为Tp分子流行病学研究提供了资料。
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3.PCR产物在pMAL-C2质粒中的定向克隆：连接混合物转化感受态细胞，在涂有X-gal和IPTG的氨苄青霉素选择性SOC培养基中，培养8 h，可见数个针尖样无色透明的小菌落，培养至12 h，实验组仅见4个中间为蓝色周围为白色的菌落，其它菌落为乳白色菌落，而对照组均为蓝色菌落。随后挑取5个白色菌落，分别接种于5ml LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/m1)中, 37℃ 200r/min振摇培养过夜，微量法快速提取质粒DNA，经1.2%琼脂糖凝胶电泳发现，重组质粒均在pMAL-C2空载体之后。将重组质粒命名为pMAL-Tppl7。
4.pMAL-Tppl7重组质粒PCR鉴定：经PCR后，电泳见到约500bp插入片段。
5.pMAL-Tpp17重组质粒限制性酶切鉴定：经XbaⅠ和PstⅠ双酶切后，电泳见到约500bp插入片段。在进行双酶切载体pMAL-C2与目的基因(Tpp17基因)时，本实验采用一步法酶切。在20μl的反应体系中，加入10×PstⅠ buffer和10×XbaⅠbuffer各1μl，限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ均可发挥高效酶切作用，简化了操作，减少2次酶切回收所造成载体pMAL-C2与Tpp17基因的丢失。
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6.Tpp17基因在大肠杆菌中的表达：pMAL-C2质粒也是一个表达载体，其启动子为Ptac，由IPTG诱导，不需亚克隆即获得了高效表达。重组质粒pMAL-Tpp17在宿主菌E.coli Kl2-TB1中，经IPTG诱导表达出一个Mr约为60×103的融合蛋白，存在于包涵体内(见图1)。其表达量随时间的延长而增加，且IPTG浓度为1mmol/L时表达量高于0.3mmol/L。IPTG浓度为1mmol/L时，诱导4 h，经凝胶扫描分析其表达量为10%。
7.Western blot分析：诱导后的细菌经纯化包涵体，SDS-PAGE后转印, Western b1ot检测20例梅毒病人血清，结果显示Mr约60×103处出现单1条带，TPPA滴度为1∶1 280带深于1∶80；5 例活动性结核病病人血清和5例健康人血清均阴性，初步应用未见假阳性，特异性和敏感性高，可能是一种诊断梅毒的实用技术。
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图1 SDS-PAGE分析Tpp17基因在E.coli K12-TB1的表达
M：标准相对分子质量；1：pMAL-C2质粒；2～4：IPTG(1mmol/L)分别诱导pMAL-C2质粒4 h、pMAL-Tpp17重组质粒1 h和4 h；5～7：IPTG(0.3mmol/L)分别诱导pMAL-Tpp17重组质粒1 h、2 h和3 h；8：IPTG(0.3mmol/L)诱导pMAL-Tpp17重组质粒2 h的包涵体
由于Tp体外培养尚未成功，Tp各种蛋白质直接分离纯化困难，我们将Tp的基因克隆入表达载体，就可简便、迅速地得到大量天然蛋白。表达的蛋白可用于：(1) 作为抗原来测定梅毒患者特异性抗体水平，诊断梅毒、疗效观察和流行病学监测等。(2) 作为基因工程蛋白疫苗进行动物实验研究。(3) 在体外研究该蛋白的结构、性质和功能。因此，Tpp17的表达成功，为研制Tp疫苗和诊断试剂提供了资料。
, http://www.100md.com 基金项目：广东省卫生科研基金资助项目(A1999556)；深圳市卫生科研基金资助项目(199806036)
参考文献
1，熊礼宽, 周华. 梅毒螺旋体部分抗原分子生物学研究进展. 国外医学流行病学传染病学分册, 1999, 26:270-273.
2，Isaacs RD, Hanke JH, Guzman-verduzco L，et al. Molecular cloning and DNA sequence analysis of the 37kD endoflagellar sheath protein gene of Treponema pallidum. Infect Immun, 1989, 57:3403-3411.
3，Sambrook J, Fristsch EF, Maniatis T. 分子克隆实验指南. 金冬雁，黎孟风，张德政，等译. 第2版. 北京：科学出版社，1998，16-60.
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4，Fraser CM, Norris SJ, Weinstock GM，et al.Complete genome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. Science, 1998, 281:375-388.
5，Akins DR，Purcell BK，Mitra MM，et al.Lipid modification of the 17kD membrane immunogen of Treponema pallidum determines macrophage activation as well as amphiphilicity. Infect Immun，1993, 61:1202-1210.
6，Pillay A, Liu H, Chen CY, et al. Molecular subtyping of Treponema pallidum subsp. pallidum. Sex Transm Dis, 1998, 25:408-414.
(收稿日期：1999-08-18), http://www.100md.com
单位：熊礼宽 周华 洪福昌 曾序春 罗斌(深圳市慢性病防治院性病防治中心)；宁波(中山医科大学免疫教研室)
关键词：
中华微生物学和免疫学杂志000605 梅毒螺旋体(Treponema pallidum subsp.pallidum，Tp)脂蛋白[相对分子质量(Mr)为17×103]是一种很强的免疫原，感染后1周内即可产生Mr为17×103的抗体〔1〕。因此，我们用PCR扩增Tp 17×103脂蛋白基因(Tpp17)，进行克隆，并对重组体pMAL-Tpp17进行了表达。
材料和方法
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主要试剂：PCR marker、蛋白质相对分子质量标准、λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ，购自华美生物工程公司；溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、十六烷基-三甲基溴化胺(CATB)、氨苄青霉素，购自Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)超纯、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K、苯*****(PMSF)，脱氧胆酸，DNA酶Ⅰ，溶菌酶，购自Merck公司；琼脂糖，Taq酶、dNTP、质粒提取试剂盒，购自Qiagene公司，XbaⅠ、E.coli Kl2-TBl，购自New Eng1and BioLab公司；限制性内切酶PstⅠ、T4 DNA ligase、琼脂糖酶和nitrocellulose膜，购自Gibco BRL公司; ExpandTM High Fidelity PCR System，购自Boehringer Mannheim公司；低熔点琼脂糖、二甲苯青，购自Pharmacia Biotech公司; 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-gal)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、N，N-二甲基甲酰胺，购自Amersco公司; 酵母提取物、胰蛋白胨、营养琼脂，购自Oxoid公司；氯化钙购自和光纯药株式会社；其它试剂均为国产分析纯。
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菌种和质粒：Tp(Nicho1s)，全国性病防治中心龚匡隆医生惠赠; LP(Leptospira)中山医科大微生物教研室惠赠。pMAL-C2购自New England BioLab公司。
TP和LP DNA提取：参照Isaacs等〔2〕介绍的方法。
引物：根据GeneBank发表的Tp 17×103外膜蛋白Tpp17基因序列，设计一对引物如下：引物1： 5′ GCGTCTAGAGTGATGAAAGGATCT 3′；引物2： 5′ CCC
TGCAGCAGACTTAACTATTT 3′； 由上海生工有限公司合成。
PCR扩增：引物l和引物2(1μg/μl)各5μl，2mmol/L dNTP 5μl, 10×PCR buffer 5μl, Tp DNA 6μl, expend Taq酶2.5U，无菌去离子水24μl, 反应条件：94℃ 5 min，94℃ 20 s，53℃ 30 s，72℃ 60 s，10个循环后，从11个循环开始，每循环1周，延伸时间延长5 s，至40个循环，最后72℃延伸10 min。
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PCR产物检测、Tpp17基因诱导表达、包涵体内表达产物检测：按《分子克隆实验指南》进行〔3〕。
PCR鉴定重组pMAL-C2/Tpp17质粒DNA：将5份重组质粒100℃煮沸10 min后，按Tpp17扩增条件扩增，电泳后观察结果。
Western b1ot分析：经SDS-PAGE后，转移至NC膜上，经1%脱脂牛奶封闭后，加入1∶100梅毒病人血清，室温摇荡60 min，洗涤后加入酶标羊抗人IgG，室温摇荡30 min，再洗涤后加入底物溶液，室温摇荡显色15 min后，加入2mol/L硫酸终止反应。20例梅毒病人血清，均经梅毒确诊试验(passiveparticle agglutination test，TPPA)证实，其滴度为1∶80～1∶1 280；5例活动性结核病病人血清和5例健康人血清均为本实验室保藏。
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1.Tp染色体DNA提取：将提取的Tp染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察点样孔一边缘有1条清晰的带。
2.PCR扩增目的基因：Tppl7基因序列已经阐明，从起始密码子到第165位碱基是编码成熟17×103的信号肽序列，从第166位碱基到第567位碱基是编码成熟Tp17×103序列〔4，5〕。我们根据所要获取Tppl7全基因序列，分别设计了5′和3′端引物序列，扩增481bp。我们在两引物的5′端分别设计了限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ的酶切位点，以便于扩增Tpp17基因定向克隆于相应的酶切载体上。此外，在限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ的酶切位点分别引入了3和2个保护性碱基，以利于酶切反应。实际扩增的PCR产物电泳30 min后，在302nm紫外灯下观察，显示约500bp处有一清晰整齐的条带，无拖尾、弥散。实验结果证明了引物设计正确。扩增Tpp17基因一方面为克隆表达打下了基础，另一方面，由于Tpp17基因片段短，也可用于临床诊断。此外，本实验扩增的Tpp17基因分别有3个和4个AluⅢ和HaeⅠ内切酶位点，可用于限制性片段长度多态性分析研究〔6〕，为Tp分子流行病学研究提供了资料。
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3.PCR产物在pMAL-C2质粒中的定向克隆：连接混合物转化感受态细胞，在涂有X-gal和IPTG的氨苄青霉素选择性SOC培养基中，培养8 h，可见数个针尖样无色透明的小菌落，培养至12 h，实验组仅见4个中间为蓝色周围为白色的菌落，其它菌落为乳白色菌落，而对照组均为蓝色菌落。随后挑取5个白色菌落，分别接种于5ml LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/m1)中, 37℃ 200r/min振摇培养过夜，微量法快速提取质粒DNA，经1.2%琼脂糖凝胶电泳发现，重组质粒均在pMAL-C2空载体之后。将重组质粒命名为pMAL-Tppl7。
4.pMAL-Tppl7重组质粒PCR鉴定：经PCR后，电泳见到约500bp插入片段。
5.pMAL-Tpp17重组质粒限制性酶切鉴定：经XbaⅠ和PstⅠ双酶切后，电泳见到约500bp插入片段。在进行双酶切载体pMAL-C2与目的基因(Tpp17基因)时，本实验采用一步法酶切。在20μl的反应体系中，加入10×PstⅠ buffer和10×XbaⅠbuffer各1μl，限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ均可发挥高效酶切作用，简化了操作，减少2次酶切回收所造成载体pMAL-C2与Tpp17基因的丢失。
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6.Tpp17基因在大肠杆菌中的表达：pMAL-C2质粒也是一个表达载体，其启动子为Ptac，由IPTG诱导，不需亚克隆即获得了高效表达。重组质粒pMAL-Tpp17在宿主菌E.coli Kl2-TB1中，经IPTG诱导表达出一个Mr约为60×103的融合蛋白，存在于包涵体内(见图1)。其表达量随时间的延长而增加，且IPTG浓度为1mmol/L时表达量高于0.3mmol/L。IPTG浓度为1mmol/L时，诱导4 h，经凝胶扫描分析其表达量为10%。
7.Western blot分析：诱导后的细菌经纯化包涵体，SDS-PAGE后转印, Western b1ot检测20例梅毒病人血清，结果显示Mr约60×103处出现单1条带，TPPA滴度为1∶1 280带深于1∶80；5 例活动性结核病病人血清和5例健康人血清均阴性，初步应用未见假阳性，特异性和敏感性高，可能是一种诊断梅毒的实用技术。
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图1 SDS-PAGE分析Tpp17基因在E.coli K12-TB1的表达
M：标准相对分子质量；1：pMAL-C2质粒；2～4：IPTG(1mmol/L)分别诱导pMAL-C2质粒4 h、pMAL-Tpp17重组质粒1 h和4 h；5～7：IPTG(0.3mmol/L)分别诱导pMAL-Tpp17重组质粒1 h、2 h和3 h；8：IPTG(0.3mmol/L)诱导pMAL-Tpp17重组质粒2 h的包涵体
由于Tp体外培养尚未成功，Tp各种蛋白质直接分离纯化困难，我们将Tp的基因克隆入表达载体，就可简便、迅速地得到大量天然蛋白。表达的蛋白可用于：(1) 作为抗原来测定梅毒患者特异性抗体水平，诊断梅毒、疗效观察和流行病学监测等。(2) 作为基因工程蛋白疫苗进行动物实验研究。(3) 在体外研究该蛋白的结构、性质和功能。因此，Tpp17的表达成功，为研制Tp疫苗和诊断试剂提供了资料。
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参考文献
1，熊礼宽, 周华. 梅毒螺旋体部分抗原分子生物学研究进展. 国外医学流行病学传染病学分册, 1999, 26:270-273.
2，Isaacs RD, Hanke JH, Guzman-verduzco L，et al. Molecular cloning and DNA sequence analysis of the 37kD endoflagellar sheath protein gene of Treponema pallidum. Infect Immun, 1989, 57:3403-3411.
3，Sambrook J, Fristsch EF, Maniatis T. 分子克隆实验指南. 金冬雁，黎孟风，张德政，等译. 第2版. 北京：科学出版社，1998，16-60.
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4，Fraser CM, Norris SJ, Weinstock GM，et al.Complete genome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. Science, 1998, 281:375-388.
5，Akins DR，Purcell BK，Mitra MM，et al.Lipid modification of the 17kD membrane immunogen of Treponema pallidum determines macrophage activation as well as amphiphilicity. Infect Immun，1993, 61:1202-1210.
6，Pillay A, Liu H, Chen CY, et al. Molecular subtyping of Treponema pallidum subsp. pallidum. Sex Transm Dis, 1998, 25:408-414.
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