肝豆状核变性基因12号外显子突变特征的研究
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37c医学网
作者：吴志英 王柠 慕容慎行 林珉婷
单位：350005 福州，福建医科大学附属第一医院神经内科
关键词：肝豆状核变性；常染色体异常；基因；突变
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 【摘要】 目的 研究中国人肝豆状核变性(WD)基因12号外显子的突变特征，为建立直接基因诊断的方法提供理论依据。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)技术，对44例无亲缘关系的确诊患者和60名正常对照组进行WD基因第12号外显子的突变检测，并用DNA测序证实其突变性质和位置。结果 8例患者在12号外显子检测到2种错义突变，占18%(8/44)，其中6例为Thr935Met突变，2例为Gly943Asp突变。结论 中国人WD基因第12号外显子的突变特征与西方人不同。这对于建立准确快速的直接基因诊断方法具有重要价值。
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Another hot point mutation of Wilson disease gene in Chinese: exon 12
WU Zhiying, WANG Ning, MURONG Shenxing, et al. Institute of Neurological Sciences, Department of Neurology, First Affiliated Hospital， Fujian Medical University, Fujian 350005, China
【Abstract】 Objectives To study the feature of disease-causing mutation of exon 12 of Wilson disease (WD) gene in Chinese and evaluate its value in direct gene diagnosis. Methods Genomic DNA of 44 unrelated WD patients and 60 normal controls was prepared from peripheral blood leukocytes by a salt-out method. The mutation of exon 12 in these subjects was identified by PCR-single strand conformation polymorphism (SSCP) and further confirmed by direct sequencing.Results Two missense mutations were identified in 8 cases(18%), including 6 cases of heterozygous for Thr935Met mutation and 2 of heterozygous for Gly943Asp mutation. Different features of mutation of exon 12 were noted between Chinese and Caucasian. Both Thr935Met and Gly943Asp were novel missense mutations and exon 12 was another hot point mutation of WD in Chinese besides exon 8. Conclusion The finding helps establish a fast and effective direct gene diagnosis.
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【Key words】 Wilson disease Chromosome abnormalities Gene Mutation
(Natl Med J China, 1999, 79：422-424)
肝豆状核变性[Wilson病(WD)]是一种伴随原发性铜代谢障碍的常染色体隐性遗传病，临床上较常见。由于铜沉积于全身各大脏器，导致本病临床症状多样化，常易误诊或漏诊，尤其在疾病早期或症状前期。应用多个短串联重复序列多态标记对有先证者WD家系的症状前患者可进行准确有效地检测[1],但对无先证者家系的临床可疑患者却无法判断，因此需建立直接检测基因突变方法进行基因诊断。WD基因共有21个外显子,目前已发现98种不同的突变形式，其中错义突变占53种[2]。国外研究表明，欧洲人以14和18号外显子为基因突变热区，其它突变均属罕见位点[3]；台湾学者和我们的研究结果均发现[4,5]，8号外显子778位点为中国人基因突变的第一热区，而14和18号外显子突变在我国患者中却非常罕见[6]。新近我们又在18 %(8/44)的患者中发现了WD基因12号外显子的2个新型错义突变, 提示该外显子为我国WD基因突变的又一热区，这对于建立我国WD病人的直接基因诊断的方法具有重要意义。
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对象与方法
一、对象
无亲缘关系的WD确诊患者44例，男25例，女19例,分别来自福建、山东、上海、浙江等地。均由我院神经内科确诊，符合WD的诊断标准: (1)有典型的临床症状; (2)血清铜蓝蛋白<200 mg/L; (3)裂隙灯下检查角膜K-F环阳性。无亲缘关系的正常对照60名,男女各半,无遗传病家族史。抽取上述研究对象外周静脉血10 ml,分离白细胞后按常规盐析法抽提基因组DNA。
二、方法
1.PCR扩增:扩增12号外显子的引物序列为：R 5′-CTTGTGGTGTTTTATTTCTTC-3′，F 5′-ACCACCAT-ATAGCCCAAG-3′，由上海生工公司合成,产物片段长度为229 bp。 50 μl反应体系中，含基因组DNA 250 ng，引物各0.25 μmol/L, dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶2.5 U及相应的10×缓冲液。采用美国MJ公司自动扩增仪扩增。条件为94℃45秒，56℃45秒，72℃1分钟，30次循环。
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2. 单链构象多态(SSCP)分析和银染:PCR扩增产物5 μl与等体积加样缓冲液混合，煮沸变性5分钟，冰浴骤冷，8%非变性胶，20℃，200 V电压电泳16小时。电泳完毕，用常规方法固定、银染、显色，拍照分析结果，并将凝胶真空抽干保存。
3.DNA序列测定:待测PCR产物经Qiaquick Spin柱(Qiagen 公司)纯化。采用美国USB公司生产的测序试剂盒(USB2.0版)、α-32P-dATP(北京亚辉公司)以及8%测序胶进行DNA双链测序，操作步骤按USB公司介绍的操作指南并加以改良。凝胶真空抽干，-70℃放射自显影18～36小时。
结 果
一、WD基因第12号外显子的PCR-SSCP检测
对60例正常对照进行PCR-SSCP检测结果发现，均只有单一的SSCP电泳带型，而44例WD患者中,36例SSCP的电泳带型与正常对照相同，另外6例和2例分别表现出两种异常的单链构象(图1)。
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二、WD基因第12号外显子的DNA测序结果
为证实上述异常单链构象的本质，我们对上述8例WD患者及5例正常对照的PCR产物进行DNA序列测定，发现6例异常单链构象相同的WD患者(图1中P1、P2、P8等)均发生了Thr935Met杂合错义突变，碱基改变为2804C→T(图2)。另2例(图1中P3等)发生了Gly943Asp杂合突变，碱基改变为2828G→A(图3)。即在18%(8/44)的WD患者中检测到12号外显子的错义突变，按受累染色体计算，突变频率约为9 %(8/88),其中,Thr935Met占7%,Gly943Asp占2%。
讨 论
国外研究表明[2,3,7-9]，WD患者发生基因突变有一定的特点:大多数表现为罕见的突变，伴随一定数目的高频突变；以杂合突变为主，纯合突变少见；突变具有遗传异质性。欧州人以发生于14号外显子的His 1 069Gln和18号外显子的Gly 1 266Arg突变频率最高，分别占28%和10%。检测这两个突变位点，有助于对1/3以上的临床可疑病例进行确诊。高加索人种以His1 069 Gln、8号外显子的2 299 insC和10号外显子的2531delA突变频率较高，分别占13%、8%和8%。而我们的研究结果表明，中国人以发生于8号外显子的Arg778Leu突变频率最高，占30%[5]，本文报道的发生于12号外显子的Thr935met突变次之，突变频率约为7%，提示Thr935met错义突变为中国人WD基因突变的另一个热区。此外在12号外显子同时还发现了Gly943Asp突变，频率达2.2%。这些发现，为建立我国WD病人的直接基因诊断的方法提供了重要依据。
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N：正常对照；P1～10：：WD病人；S1、S2：正常单链条带；
B1、B2、B3：异常泳动的单链条带；Ds：双链条带
图1 WD基因12号外显子PCR-SSCP电泳结果
Thr：苏氨酸，Met：甲硫氨酸；箭头指向突变位置
图2 WD基因Thr935Met(2804C→T)错义突变(杂合)测序照片
Gly:甘氨酸，Asp:门冬氨酸；箭头指向突变位置
图3 WD基因Gly943Asp(2828G→A)错义突变(杂合)测序照片
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国外在12号外显子发现的错义突变有Arg919Gly、Leu936ter和Gly943ser，均属罕见突变，频率极低[3]。我们所报道的这两种新型错义突变则较为常见，且均是非保守性质的突变，即碱基的改变导致了所编码的氨基酸性质的明显改变，其中，2 804C→T的改变导致Thr935met，使亲水氨基酸变成疏水氨基酸，而2 828G→A的改变导致Gly943Asp，使中性非极性氨基酸变成了带有极性基团的酸性氨基酸，从而破坏了ATP酶第5跨膜区的结构，导致WD蛋白转运铜的水平降低，使患者致病。本研究结果提示，中国人WD基因12号外显子发生突变的频率及性质均与西方人存在明显差异。
国外文献报道[3，10]WD基因突变以杂合突变占绝大多数,且同一个病人可分别在两条染色体上检测到不同性质的突变,我们的结果亦有类似情况。4例发生Thr935Met杂合突变的患者中3例伴有Arg778Leu杂合突变，1例伴有Ileu 1 148Thr杂合突变；另有1例发生Gly943Ser杂合突变者伴有Asn1 269Ser杂合突变，即8例在12号外显子检测到杂合突变的患者中，5例均在另一条染色体上检测到其他外显子杂合突变，占63%。WD是常染色体隐性遗传病，检测到纯合突变，表明该突变即为致病的原因，若检测到杂合突变，理论上应伴随有其它性质的杂合突变，从而使患者致病。但能否检测出所有的突变，则有赖于检测技术的敏感性和准确性。
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注释：本课题为卫生部优秀青年科技人才基金(97082)和福建省卫生厅科研基金资助项目(96A032)
参考文献
1 吴志英,余龙,王柠,等.基因短串联重复序列多态标记诊断肝豆状核变性.中华医学杂
志,1996,76:578-581.
2 Kalinsky H, Funes A, Zeldin A, et al. Novel ATP7B mutations causing Wilson disease
in several Israeli ethnic groups. Hum Mutat，1998，11:145-151.
3 Thomas GR, Forbes JR, Roberts EA, et al. The Wilson disease gene:spectrum of
, http://www.100md.com
mutations and their consequences. Nat Genet, 1995,9:210-217.
4 Chuang LM, Wu HP, Jang MH, et al. High frequency of two mutations in codon 778 in
exon 8 of the ATP7B gene in Taiwanese families with Wilson disease. J Med Genet,1996,33:521-523.
5 王柠,吴志英,慕容慎行,等.经DNA测序证实的肝豆状核变性基因突变热区的研究. 中华神经
科杂志,1998,31：20-23.
6 吴志英，慕容慎行,王柠,等.中国人肝豆状核变性基因第14、18和5号外显子突变及多态研究.
, http://www.100md.com
临床神经病学杂志,1997,10：259-261.
7 Figus A, Angius A, Loudianos G, et al. Molecular pathology and haplotype analysis
of Wilson disease in Mediterranean population. Am J Hum Genet. 1995, 57:1318-
1324.
8 Loudianos G, Dessi V, Angius A, et al. Wilson disease mutations associated With
uncommon haplotypes in Mediterranean patients. Hum Genet. 1996,11:640-642.
, 百拇医药
9 Waldenstrom E, Lagerkvist A, Dahlman T, et al. Efficient detection of Mutation in
Wilson disease by manifold sequencing. Genomics, 1996, 37 :303-309.
10 Kemppainen R, Palatsi R, Kallioninen M, et al. A homozygous nonsense mutation and
a combination of two mutations of the Wilson disease gene in patients with
different lysyl oxidase activities in cultured fibroblasts. J Invest Dermatol,1997, 108:35-39.
收稿：1998-07-23 修回：1998-12-10, 百拇医药
单位：350005 福州，福建医科大学附属第一医院神经内科
关键词：肝豆状核变性；常染色体异常；基因；突变
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 【摘要】 目的 研究中国人肝豆状核变性(WD)基因12号外显子的突变特征，为建立直接基因诊断的方法提供理论依据。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)技术，对44例无亲缘关系的确诊患者和60名正常对照组进行WD基因第12号外显子的突变检测，并用DNA测序证实其突变性质和位置。结果 8例患者在12号外显子检测到2种错义突变，占18%(8/44)，其中6例为Thr935Met突变，2例为Gly943Asp突变。结论 中国人WD基因第12号外显子的突变特征与西方人不同。这对于建立准确快速的直接基因诊断方法具有重要价值。
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Another hot point mutation of Wilson disease gene in Chinese: exon 12
WU Zhiying, WANG Ning, MURONG Shenxing, et al. Institute of Neurological Sciences, Department of Neurology, First Affiliated Hospital， Fujian Medical University, Fujian 350005, China
【Abstract】 Objectives To study the feature of disease-causing mutation of exon 12 of Wilson disease (WD) gene in Chinese and evaluate its value in direct gene diagnosis. Methods Genomic DNA of 44 unrelated WD patients and 60 normal controls was prepared from peripheral blood leukocytes by a salt-out method. The mutation of exon 12 in these subjects was identified by PCR-single strand conformation polymorphism (SSCP) and further confirmed by direct sequencing.Results Two missense mutations were identified in 8 cases(18%), including 6 cases of heterozygous for Thr935Met mutation and 2 of heterozygous for Gly943Asp mutation. Different features of mutation of exon 12 were noted between Chinese and Caucasian. Both Thr935Met and Gly943Asp were novel missense mutations and exon 12 was another hot point mutation of WD in Chinese besides exon 8. Conclusion The finding helps establish a fast and effective direct gene diagnosis.
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【Key words】 Wilson disease Chromosome abnormalities Gene Mutation
(Natl Med J China, 1999, 79：422-424)
肝豆状核变性[Wilson病(WD)]是一种伴随原发性铜代谢障碍的常染色体隐性遗传病，临床上较常见。由于铜沉积于全身各大脏器，导致本病临床症状多样化，常易误诊或漏诊，尤其在疾病早期或症状前期。应用多个短串联重复序列多态标记对有先证者WD家系的症状前患者可进行准确有效地检测[1],但对无先证者家系的临床可疑患者却无法判断，因此需建立直接检测基因突变方法进行基因诊断。WD基因共有21个外显子,目前已发现98种不同的突变形式，其中错义突变占53种[2]。国外研究表明，欧洲人以14和18号外显子为基因突变热区，其它突变均属罕见位点[3]；台湾学者和我们的研究结果均发现[4,5]，8号外显子778位点为中国人基因突变的第一热区，而14和18号外显子突变在我国患者中却非常罕见[6]。新近我们又在18 %(8/44)的患者中发现了WD基因12号外显子的2个新型错义突变, 提示该外显子为我国WD基因突变的又一热区，这对于建立我国WD病人的直接基因诊断的方法具有重要意义。
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对象与方法
一、对象
无亲缘关系的WD确诊患者44例，男25例，女19例,分别来自福建、山东、上海、浙江等地。均由我院神经内科确诊，符合WD的诊断标准: (1)有典型的临床症状; (2)血清铜蓝蛋白<200 mg/L; (3)裂隙灯下检查角膜K-F环阳性。无亲缘关系的正常对照60名,男女各半,无遗传病家族史。抽取上述研究对象外周静脉血10 ml,分离白细胞后按常规盐析法抽提基因组DNA。
二、方法
1.PCR扩增:扩增12号外显子的引物序列为：R 5′-CTTGTGGTGTTTTATTTCTTC-3′，F 5′-ACCACCAT-ATAGCCCAAG-3′，由上海生工公司合成,产物片段长度为229 bp。 50 μl反应体系中，含基因组DNA 250 ng，引物各0.25 μmol/L, dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶2.5 U及相应的10×缓冲液。采用美国MJ公司自动扩增仪扩增。条件为94℃45秒，56℃45秒，72℃1分钟，30次循环。
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2. 单链构象多态(SSCP)分析和银染:PCR扩增产物5 μl与等体积加样缓冲液混合，煮沸变性5分钟，冰浴骤冷，8%非变性胶，20℃，200 V电压电泳16小时。电泳完毕，用常规方法固定、银染、显色，拍照分析结果，并将凝胶真空抽干保存。
3.DNA序列测定:待测PCR产物经Qiaquick Spin柱(Qiagen 公司)纯化。采用美国USB公司生产的测序试剂盒(USB2.0版)、α-32P-dATP(北京亚辉公司)以及8%测序胶进行DNA双链测序，操作步骤按USB公司介绍的操作指南并加以改良。凝胶真空抽干，-70℃放射自显影18～36小时。
结 果
一、WD基因第12号外显子的PCR-SSCP检测
对60例正常对照进行PCR-SSCP检测结果发现，均只有单一的SSCP电泳带型，而44例WD患者中,36例SSCP的电泳带型与正常对照相同，另外6例和2例分别表现出两种异常的单链构象(图1)。
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二、WD基因第12号外显子的DNA测序结果
为证实上述异常单链构象的本质，我们对上述8例WD患者及5例正常对照的PCR产物进行DNA序列测定，发现6例异常单链构象相同的WD患者(图1中P1、P2、P8等)均发生了Thr935Met杂合错义突变，碱基改变为2804C→T(图2)。另2例(图1中P3等)发生了Gly943Asp杂合突变，碱基改变为2828G→A(图3)。即在18%(8/44)的WD患者中检测到12号外显子的错义突变，按受累染色体计算，突变频率约为9 %(8/88),其中,Thr935Met占7%,Gly943Asp占2%。
讨 论
国外研究表明[2,3,7-9]，WD患者发生基因突变有一定的特点:大多数表现为罕见的突变，伴随一定数目的高频突变；以杂合突变为主，纯合突变少见；突变具有遗传异质性。欧州人以发生于14号外显子的His 1 069Gln和18号外显子的Gly 1 266Arg突变频率最高，分别占28%和10%。检测这两个突变位点，有助于对1/3以上的临床可疑病例进行确诊。高加索人种以His1 069 Gln、8号外显子的2 299 insC和10号外显子的2531delA突变频率较高，分别占13%、8%和8%。而我们的研究结果表明，中国人以发生于8号外显子的Arg778Leu突变频率最高，占30%[5]，本文报道的发生于12号外显子的Thr935met突变次之，突变频率约为7%，提示Thr935met错义突变为中国人WD基因突变的另一个热区。此外在12号外显子同时还发现了Gly943Asp突变，频率达2.2%。这些发现，为建立我国WD病人的直接基因诊断的方法提供了重要依据。
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N：正常对照；P1～10：：WD病人；S1、S2：正常单链条带；
B1、B2、B3：异常泳动的单链条带；Ds：双链条带
图1 WD基因12号外显子PCR-SSCP电泳结果
Thr：苏氨酸，Met：甲硫氨酸；箭头指向突变位置
图2 WD基因Thr935Met(2804C→T)错义突变(杂合)测序照片
Gly:甘氨酸，Asp:门冬氨酸；箭头指向突变位置
图3 WD基因Gly943Asp(2828G→A)错义突变(杂合)测序照片
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国外在12号外显子发现的错义突变有Arg919Gly、Leu936ter和Gly943ser，均属罕见突变，频率极低[3]。我们所报道的这两种新型错义突变则较为常见，且均是非保守性质的突变，即碱基的改变导致了所编码的氨基酸性质的明显改变，其中，2 804C→T的改变导致Thr935met，使亲水氨基酸变成疏水氨基酸，而2 828G→A的改变导致Gly943Asp，使中性非极性氨基酸变成了带有极性基团的酸性氨基酸，从而破坏了ATP酶第5跨膜区的结构，导致WD蛋白转运铜的水平降低，使患者致病。本研究结果提示，中国人WD基因12号外显子发生突变的频率及性质均与西方人存在明显差异。
国外文献报道[3，10]WD基因突变以杂合突变占绝大多数,且同一个病人可分别在两条染色体上检测到不同性质的突变,我们的结果亦有类似情况。4例发生Thr935Met杂合突变的患者中3例伴有Arg778Leu杂合突变，1例伴有Ileu 1 148Thr杂合突变；另有1例发生Gly943Ser杂合突变者伴有Asn1 269Ser杂合突变，即8例在12号外显子检测到杂合突变的患者中，5例均在另一条染色体上检测到其他外显子杂合突变，占63%。WD是常染色体隐性遗传病，检测到纯合突变，表明该突变即为致病的原因，若检测到杂合突变，理论上应伴随有其它性质的杂合突变，从而使患者致病。但能否检测出所有的突变，则有赖于检测技术的敏感性和准确性。
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注释：本课题为卫生部优秀青年科技人才基金(97082)和福建省卫生厅科研基金资助项目(96A032)
参考文献
1 吴志英,余龙,王柠,等.基因短串联重复序列多态标记诊断肝豆状核变性.中华医学杂
志,1996,76:578-581.
2 Kalinsky H, Funes A, Zeldin A, et al. Novel ATP7B mutations causing Wilson disease
in several Israeli ethnic groups. Hum Mutat，1998，11:145-151.
3 Thomas GR, Forbes JR, Roberts EA, et al. The Wilson disease gene:spectrum of
, http://www.100md.com
mutations and their consequences. Nat Genet, 1995,9:210-217.
4 Chuang LM, Wu HP, Jang MH, et al. High frequency of two mutations in codon 778 in
exon 8 of the ATP7B gene in Taiwanese families with Wilson disease. J Med Genet,1996,33:521-523.
5 王柠,吴志英,慕容慎行,等.经DNA测序证实的肝豆状核变性基因突变热区的研究. 中华神经
科杂志,1998,31：20-23.
6 吴志英，慕容慎行,王柠,等.中国人肝豆状核变性基因第14、18和5号外显子突变及多态研究.
, http://www.100md.com
临床神经病学杂志,1997,10：259-261.
7 Figus A, Angius A, Loudianos G, et al. Molecular pathology and haplotype analysis
of Wilson disease in Mediterranean population. Am J Hum Genet. 1995, 57:1318-
1324.
8 Loudianos G, Dessi V, Angius A, et al. Wilson disease mutations associated With
uncommon haplotypes in Mediterranean patients. Hum Genet. 1996,11:640-642.
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9 Waldenstrom E, Lagerkvist A, Dahlman T, et al. Efficient detection of Mutation in
Wilson disease by manifold sequencing. Genomics, 1996, 37 :303-309.
10 Kemppainen R, Palatsi R, Kallioninen M, et al. A homozygous nonsense mutation and
a combination of two mutations of the Wilson disease gene in patients with
different lysyl oxidase activities in cultured fibroblasts. J Invest Dermatol,1997, 108:35-39.
收稿：1998-07-23 修回：1998-12-10, 百拇医药