离子通道在卵母细胞中的表达及电生理实验方法
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作者：蒋学俊 李晓艳 Randall L Rasmusson
单位：蒋学俊 Randall L Rasmusson(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)；李晓艳(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
关键词：
中国心脏起搏与心电生理杂志000322 中图分类号 Q813.1+1 R331.3+8 文献标识码 A
文章编号 1007—2659(2000)03—0210—03
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Ⅱ 卵母细胞的电生理实验方法
1 双微电极电压钳制法(two electrode voltageclamp，TEV)是卵母细胞电生理实验的基本方法。该方法操作简便。实际工作中也可用来筛选电流表达较好的卵母细胞进行cut-open及macro-patch实验。
1.1 基本原理 TEV需用两个电极插入细胞内，一个用于电位的钳制，一个用于通道电流的记录。参见图1。
图1 双微电极电压钳制法电路模式图
1.2 仪器、设备 多家公司提供双微电极电压钳制所需的放大器。以DAGAN公司为例，有CA-1B，TEV-200A，Cell clamp2等多种型号供选择。其他设备需显微镜一台，示波器一台，三维微操纵器两个，数模转换器、计算机及相关软件一套。记录槽可选用Warner公司的RC系列，具体方法可在http://www.warnerinstrument.com网站上查找。
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实验要求仪器有良好的稳定性和接地。相对而言，本方法对环境要求并不很高，无气垫屏蔽台也可。
电极：实验所需电极尖端直径约1～5 μm，电阻在0.5～1.5 MΩ之间。常规的电极拉制器即可满足需要，拉制好的电极在一定湿度的容器中可保存数天。有人认为，只要电极的电阻合适，电极可反复使用，但我们均为一次性使用。
琼脂糖盐桥：实验需2～3个琼脂糖盐桥，浓度为1%～2%，置入相应大小的支持物中，其内充以3M的KCl溶液。三个盐桥一端置入记录槽中，一端连接于P1，P2及V2。以CA-1B为例，headstage V1用于电压的钳制，Vi则用于通道电流的记录。
1.3 实验方法 首先在记录槽底部正中粘上一小片网格状薄片，或用刀片在记录槽底部划出网格状细槽，以防止钳制和灌流时卵母细胞在底部滑动。挑选状态良好的细胞置入正中，使着色部分朝上，这样易于看清针尖的位置。
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在拉制好的电极中充以3M的KCl溶液，插入到headstage上，待针尖进入液面后，将放大器上的V1，V2，Vi电位调节至零电位，同时测量电极的电阻是否满足要求。
卵母细胞体积较大，准确判断针尖和细胞的相对位置十分重要，需要足够的耐心和反复实践。如果使用倒置显微镜，针尖位置更难看清，可用以下方法判断：两电极以45°从左右两个方向穿刺。首先调节焦距使卵母细胞的边缘清晰(位置A)，然后调节焦距使细胞底部平面清晰(位置B)，AB之间的距离(a)相当于卵母细胞的半径，再将焦距从位置A向相反方向转动相同的距离(位置C)，使AC＝AB，小心调节电极位置使其尖端位于C平面和卵母细胞边缘处(图2)。此时应观察放大器上膜电位的变化，以此判断电极尖端的位置。当电极接触到细胞膜时，膜电位可能有轻微的变化，再稍向下旋转，电极刺入细胞，膜电位一般在-20～-80 mV。注意穿刺的角度很重要，角度不准则位置判断可能出现偏差，导致钳制失败或漏电流过大。
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图2 微电极穿刺卵母细胞的侧面观(上图)和上面观(下图)
穿刺成功后即可实现电压钳制，记录通道电流。实际上，电压钳制是将记录槽中的液体均钳制到同一电位，液体过多容易造成振荡，因此记录时应尽可能降低记录槽中液面水平。
液体灌流：本方法可很方便进行细胞外灌流。使用重力即可实现有效灌流，也可用吸管手工进行灌流,另一端用负压抽吸。灌流过程中降低Clamp Gain，避免振荡。如果需要在记录过程中持续灌流，应保持匀速，同时保持较低的液面水平。
1.4 小结
TEV是卵母细胞电生理实验的基本方法，主要的优点在于：操作简单，对设备要求不高；记录稳定，可长达数小时；细胞外灌流简便；对电流大小要求不高；相对而言，对细胞状态的要求也不是很严格。
主要问题：本方法时间和空间上的分辨率不高，如果需要记录很快的信号，则要用patch clamp技术。另一个主要问题是实验过程中电极的电阻可能增加，常引起振荡，影响钳制。电极插入细胞后可能出现两种情况：一是细胞内成分通过电极尖端渗入到电极中，另一种情况是电极内液渗入到胞浆中，前者是引起电极电阻增高的主要原因。因此，比较理想的情况是使电极内的液体缓慢外渗，但这很难预测和控制，因此常需在怀疑电阻增高时测量电极的电阻。
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2 macro-patch voltage clamp 和 giant-patch voltage clamp
Macro-patch和giant-patch电压钳方法实际上是从膜片钳技术上发展出来的，主要的差别在于电极尖端直径较大，可记录到几个至几十个通道的电流，适用于通道电流密度较低的情况。此方法也可形成内面向外(inside-out)和外面向外(outside-out)的记录方式，对研究细胞内、外环境对通道功能的影响有很重要的作用。
2.1 基本原理 同patch-clamp原理相似。通过特殊处理的电极，使电极尖端和细胞膜表面形成1～100 GΩ的高阻抗封接。形成这种紧密封接后，不仅可进行细胞贴附(cell attached)式记录，还可将膜片从细胞上游离下来，进行内面向外或外面向外的记录。记录的方法以及得到的电流图形和全细胞记录技术相近。
2.2 仪器 与常规膜片钳技术一样，包括放大器、显微镜、示波器、三维微操纵器、数模转换器、计算机及相关软件。
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实验需良好的稳定性和接地，本方法对环境要求较高，应在气垫屏蔽台中进行实验。
2.3 电极 电极处理是本方法最重要的部分之一。
用于macro-patch的电极尖端大小一般在5～10 μm，电阻小于1 MΩ。电极可用常规电极拉制器拉制，并在电极前端涂抹一薄层硅酮树酯(sylgard)。Sylgard是由两部分在使用前混合而成，可在4℃下保存一周。涂抹时注意不要影响电极尖端，尾端应超出液面水平。处理的目的在于减小电极和细胞外液之间的电容，并形成亲水界面。处理后的电极对封接并无影响，但可明显降低本底噪音。此后电极还需抛光，在显微镜下将电极尖端靠近铂金丝，通电加热时，电极尖端微微回缩，尖端更加光滑，易于封接。
用于giant-patch的电极尖端更大，直径在20～40 μm，电阻在200 KΩ以下。常规方法拉制的电极无法满足这样的要求，因此拉制后需切去尖端。在抛光器上换为直径0.3～0.6 mm的铂金丝，通电加热后，用低熔点的软质玻璃拉制的电极接触铂金丝，此电极尖端则在铂金丝上熔化形成球状。移走此电极，将待切的电极逐渐靠近铂金丝，稍加热，待玻璃球熔时，将电极尖端插入到玻璃球中，断电使铂金丝上玻璃球快速冷却，迅速提起电极，电极尖端与玻璃球融在一起而被切断，见图3。如果电极尖端不理想，可重复数次直至满足实验需要。
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电极处理的第二步是抛光，抛光过程与其他的电极处理相同。图4示抛光前后电极尖端的形状。
图3 电极制备过程图示
图4 电极尖端抛光前后对比 抛光前(左)，抛光后(右)
为降低噪音，增加高阻封接的成功率，还需在抛光后的电极上涂以一种混合物。混合物常用配方为：在等量的轻、重矿物油中加入5%～10%的石蜡膜(parafilm)，稍加热，不断搅拌至胶状。如混合物较稀薄，则将电极在其中快速蘸一下取出，电极前端会形成一层薄膜。如混合物较为粘稠，则用细玻棒蘸取后，在显微镜下小心涂抹于电极的前端。涂抹后封接可能更为困难，但一旦封接成功，则较为稳定，有利于细胞膜片的游离。在混合物中加入5%～10%的蜡可能会提高封接的稳定性。
, 百拇医药
2.4 高阻封接的形成 总的说来，实验技术和心肌细胞膜片钳技术方法相似，因此不再重复。根据卵母细胞的特点，以下几点与小细胞的封接技术有所不同。
(1)一般而言，心肌细胞实验中电极的角度以45°为宜，但对于卵母细胞的钳制，角度应较平，一方面易于封接，另一方面也有利于膜片的游离。
(2)相对而言，卵母细胞的高阻封接较为困难。阻抗从几十兆到几百兆增加较快，但几百兆到千兆封接的形成可能需数分钟的时间。此时，给予轻度的刺激可能有所帮助。少数情况下，也可以和小细胞一样很快封接成功。
(3)实验条件要求更高，实验台的稳定和良好的接地均十分重要，尤其在膜片游离以后，任何轻微的干扰都可能导致高阻封接脱落。
(4)膜片游离后，有效的实验时间一般仅能维持15～30 min，因此实验设计和信号采集均需周密计划。
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(5)本方法形成外面向外方式比较困难。若实验需要，则应选用厚壁的电极管拉制电极。实验过程参见图5。
图5 内面向外和外面向外实验方法模式图
(6)本方法最主要的特点之一是可以很方便地进行细胞内(inside-out)或细胞外(outside-out)的灌流，因此，灌流的装置和方法就显得十分重要。由于实验时间有限，必须强调局部灌流，即用很精细的毛细管从游离膜片的对面直接进行灌流。首先，必须保证灌流的有效性，可在显微镜下观察灌流液是否直接冲向游离的细胞膜。第二，必须保证灌流时封接的稳定性。因此在正式实验前，应预先测定不同的灌流速度(在保证有效灌流的前提下)时封接稳定的维持时间。第三，实验中常常需要记录很快的信号变化，有时需观察灌流液切换过程中通道电流的动态变化，因此，灌流的控制建议采用数字控制(开-关)和压力控制(流速)。可参考ALA公司的灌流系统ALA-BPA系列和压力调节系统PR-10(http://www.alascience.com)。
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2.5 小结
主要优点：电极尖端大，可记录到多个通道的电流，可用于电导较低的通道；具有很高的时间和空间分辨率；形成内面向外的方式后，可很方便地控制细胞内成分，且不受细胞内其他间接因素的影响。
主要缺点：实验对设备环境要求高，对细胞的状态和电流大小要求均高，TEV方法记录到细胞电流在10 μA以上时，才有可能用本方法记录到电流；实验时间较短，大多在30 min以内；一般情况下，外面向外方式很难成功。
(待续)
作者简介：蒋学俊(1967— )，男(汉族)，湖北武汉人，博士后，现从事心血管的临床及基础研究。
(2000-10-07收稿), 百拇医药
单位：蒋学俊 Randall L Rasmusson(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)；李晓艳(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
关键词：
中国心脏起搏与心电生理杂志000322 中图分类号 Q813.1+1 R331.3+8 文献标识码 A
文章编号 1007—2659(2000)03—0210—03
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Ⅱ 卵母细胞的电生理实验方法
1 双微电极电压钳制法(two electrode voltageclamp，TEV)是卵母细胞电生理实验的基本方法。该方法操作简便。实际工作中也可用来筛选电流表达较好的卵母细胞进行cut-open及macro-patch实验。
1.1 基本原理 TEV需用两个电极插入细胞内，一个用于电位的钳制，一个用于通道电流的记录。参见图1。
图1 双微电极电压钳制法电路模式图
1.2 仪器、设备 多家公司提供双微电极电压钳制所需的放大器。以DAGAN公司为例，有CA-1B，TEV-200A，Cell clamp2等多种型号供选择。其他设备需显微镜一台，示波器一台，三维微操纵器两个，数模转换器、计算机及相关软件一套。记录槽可选用Warner公司的RC系列，具体方法可在http://www.warnerinstrument.com网站上查找。
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实验要求仪器有良好的稳定性和接地。相对而言，本方法对环境要求并不很高，无气垫屏蔽台也可。
电极：实验所需电极尖端直径约1～5 μm，电阻在0.5～1.5 MΩ之间。常规的电极拉制器即可满足需要，拉制好的电极在一定湿度的容器中可保存数天。有人认为，只要电极的电阻合适，电极可反复使用，但我们均为一次性使用。
琼脂糖盐桥：实验需2～3个琼脂糖盐桥，浓度为1%～2%，置入相应大小的支持物中，其内充以3M的KCl溶液。三个盐桥一端置入记录槽中，一端连接于P1，P2及V2。以CA-1B为例，headstage V1用于电压的钳制，Vi则用于通道电流的记录。
1.3 实验方法 首先在记录槽底部正中粘上一小片网格状薄片，或用刀片在记录槽底部划出网格状细槽，以防止钳制和灌流时卵母细胞在底部滑动。挑选状态良好的细胞置入正中，使着色部分朝上，这样易于看清针尖的位置。
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在拉制好的电极中充以3M的KCl溶液，插入到headstage上，待针尖进入液面后，将放大器上的V1，V2，Vi电位调节至零电位，同时测量电极的电阻是否满足要求。
卵母细胞体积较大，准确判断针尖和细胞的相对位置十分重要，需要足够的耐心和反复实践。如果使用倒置显微镜，针尖位置更难看清，可用以下方法判断：两电极以45°从左右两个方向穿刺。首先调节焦距使卵母细胞的边缘清晰(位置A)，然后调节焦距使细胞底部平面清晰(位置B)，AB之间的距离(a)相当于卵母细胞的半径，再将焦距从位置A向相反方向转动相同的距离(位置C)，使AC＝AB，小心调节电极位置使其尖端位于C平面和卵母细胞边缘处(图2)。此时应观察放大器上膜电位的变化，以此判断电极尖端的位置。当电极接触到细胞膜时，膜电位可能有轻微的变化，再稍向下旋转，电极刺入细胞，膜电位一般在-20～-80 mV。注意穿刺的角度很重要，角度不准则位置判断可能出现偏差，导致钳制失败或漏电流过大。
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图2 微电极穿刺卵母细胞的侧面观(上图)和上面观(下图)
穿刺成功后即可实现电压钳制，记录通道电流。实际上，电压钳制是将记录槽中的液体均钳制到同一电位，液体过多容易造成振荡，因此记录时应尽可能降低记录槽中液面水平。
液体灌流：本方法可很方便进行细胞外灌流。使用重力即可实现有效灌流，也可用吸管手工进行灌流,另一端用负压抽吸。灌流过程中降低Clamp Gain，避免振荡。如果需要在记录过程中持续灌流，应保持匀速，同时保持较低的液面水平。
1.4 小结
TEV是卵母细胞电生理实验的基本方法，主要的优点在于：操作简单，对设备要求不高；记录稳定，可长达数小时；细胞外灌流简便；对电流大小要求不高；相对而言，对细胞状态的要求也不是很严格。
主要问题：本方法时间和空间上的分辨率不高，如果需要记录很快的信号，则要用patch clamp技术。另一个主要问题是实验过程中电极的电阻可能增加，常引起振荡，影响钳制。电极插入细胞后可能出现两种情况：一是细胞内成分通过电极尖端渗入到电极中，另一种情况是电极内液渗入到胞浆中，前者是引起电极电阻增高的主要原因。因此，比较理想的情况是使电极内的液体缓慢外渗，但这很难预测和控制，因此常需在怀疑电阻增高时测量电极的电阻。
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2 macro-patch voltage clamp 和 giant-patch voltage clamp
Macro-patch和giant-patch电压钳方法实际上是从膜片钳技术上发展出来的，主要的差别在于电极尖端直径较大，可记录到几个至几十个通道的电流，适用于通道电流密度较低的情况。此方法也可形成内面向外(inside-out)和外面向外(outside-out)的记录方式，对研究细胞内、外环境对通道功能的影响有很重要的作用。
2.1 基本原理 同patch-clamp原理相似。通过特殊处理的电极，使电极尖端和细胞膜表面形成1～100 GΩ的高阻抗封接。形成这种紧密封接后，不仅可进行细胞贴附(cell attached)式记录，还可将膜片从细胞上游离下来，进行内面向外或外面向外的记录。记录的方法以及得到的电流图形和全细胞记录技术相近。
2.2 仪器 与常规膜片钳技术一样，包括放大器、显微镜、示波器、三维微操纵器、数模转换器、计算机及相关软件。
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实验需良好的稳定性和接地，本方法对环境要求较高，应在气垫屏蔽台中进行实验。
2.3 电极 电极处理是本方法最重要的部分之一。
用于macro-patch的电极尖端大小一般在5～10 μm，电阻小于1 MΩ。电极可用常规电极拉制器拉制，并在电极前端涂抹一薄层硅酮树酯(sylgard)。Sylgard是由两部分在使用前混合而成，可在4℃下保存一周。涂抹时注意不要影响电极尖端，尾端应超出液面水平。处理的目的在于减小电极和细胞外液之间的电容，并形成亲水界面。处理后的电极对封接并无影响，但可明显降低本底噪音。此后电极还需抛光，在显微镜下将电极尖端靠近铂金丝，通电加热时，电极尖端微微回缩，尖端更加光滑，易于封接。
用于giant-patch的电极尖端更大，直径在20～40 μm，电阻在200 KΩ以下。常规方法拉制的电极无法满足这样的要求，因此拉制后需切去尖端。在抛光器上换为直径0.3～0.6 mm的铂金丝，通电加热后，用低熔点的软质玻璃拉制的电极接触铂金丝，此电极尖端则在铂金丝上熔化形成球状。移走此电极，将待切的电极逐渐靠近铂金丝，稍加热，待玻璃球熔时，将电极尖端插入到玻璃球中，断电使铂金丝上玻璃球快速冷却，迅速提起电极，电极尖端与玻璃球融在一起而被切断，见图3。如果电极尖端不理想，可重复数次直至满足实验需要。
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电极处理的第二步是抛光，抛光过程与其他的电极处理相同。图4示抛光前后电极尖端的形状。
图3 电极制备过程图示
图4 电极尖端抛光前后对比 抛光前(左)，抛光后(右)
为降低噪音，增加高阻封接的成功率，还需在抛光后的电极上涂以一种混合物。混合物常用配方为：在等量的轻、重矿物油中加入5%～10%的石蜡膜(parafilm)，稍加热，不断搅拌至胶状。如混合物较稀薄，则将电极在其中快速蘸一下取出，电极前端会形成一层薄膜。如混合物较为粘稠，则用细玻棒蘸取后，在显微镜下小心涂抹于电极的前端。涂抹后封接可能更为困难，但一旦封接成功，则较为稳定，有利于细胞膜片的游离。在混合物中加入5%～10%的蜡可能会提高封接的稳定性。
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2.4 高阻封接的形成 总的说来，实验技术和心肌细胞膜片钳技术方法相似，因此不再重复。根据卵母细胞的特点，以下几点与小细胞的封接技术有所不同。
(1)一般而言，心肌细胞实验中电极的角度以45°为宜，但对于卵母细胞的钳制，角度应较平，一方面易于封接，另一方面也有利于膜片的游离。
(2)相对而言，卵母细胞的高阻封接较为困难。阻抗从几十兆到几百兆增加较快，但几百兆到千兆封接的形成可能需数分钟的时间。此时，给予轻度的刺激可能有所帮助。少数情况下，也可以和小细胞一样很快封接成功。
(3)实验条件要求更高，实验台的稳定和良好的接地均十分重要，尤其在膜片游离以后，任何轻微的干扰都可能导致高阻封接脱落。
(4)膜片游离后，有效的实验时间一般仅能维持15～30 min，因此实验设计和信号采集均需周密计划。
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(5)本方法形成外面向外方式比较困难。若实验需要，则应选用厚壁的电极管拉制电极。实验过程参见图5。
图5 内面向外和外面向外实验方法模式图
(6)本方法最主要的特点之一是可以很方便地进行细胞内(inside-out)或细胞外(outside-out)的灌流，因此，灌流的装置和方法就显得十分重要。由于实验时间有限，必须强调局部灌流，即用很精细的毛细管从游离膜片的对面直接进行灌流。首先，必须保证灌流的有效性，可在显微镜下观察灌流液是否直接冲向游离的细胞膜。第二，必须保证灌流时封接的稳定性。因此在正式实验前，应预先测定不同的灌流速度(在保证有效灌流的前提下)时封接稳定的维持时间。第三，实验中常常需要记录很快的信号变化，有时需观察灌流液切换过程中通道电流的动态变化，因此，灌流的控制建议采用数字控制(开-关)和压力控制(流速)。可参考ALA公司的灌流系统ALA-BPA系列和压力调节系统PR-10(http://www.alascience.com)。
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2.5 小结
主要优点：电极尖端大，可记录到多个通道的电流，可用于电导较低的通道；具有很高的时间和空间分辨率；形成内面向外的方式后，可很方便地控制细胞内成分，且不受细胞内其他间接因素的影响。
主要缺点：实验对设备环境要求高，对细胞的状态和电流大小要求均高，TEV方法记录到细胞电流在10 μA以上时，才有可能用本方法记录到电流；实验时间较短，大多在30 min以内；一般情况下，外面向外方式很难成功。
(待续)
作者简介：蒋学俊(1967— )，男(汉族)，湖北武汉人，博士后，现从事心血管的临床及基础研究。
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