人生殖细胞的冷冻保存
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作者：李庆雷 倪江
单位：李庆雷(哈尔滨医科大学 生理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 倪江(哈尔滨医科大学 生理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：生殖细胞；冷冻保存；保护剂
哈尔滨医科大学学报000136 分类号：R321.1 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0075-02▲
随着低温生物学技术和体外受精-胚胎移植术(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)的不断发展，人精子及胚胎已被成功的冷冻保存并应用于临床实践中。目前，卵母细胞的冷冻保存虽然仍处于实验阶段[1，2]，但已有数例关于冷冻保存卵子成功受孕并分娩出健康胎儿的报道。
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1 人生殖细胞冷冻保存的简史
人精子冷冻贮存的历史可追溯到1776年，Spallanzarni发现埋于冰雪中的人精液复温后有部分精子存活。1866年Montegazza成功地在-15℃保存了人精子。Hoagland和Pricus于1942年用快速冷冻法将人精子保存于-196℃液氮中。1953年Sherman用冷冻的精子进行人工授精获得成功。10年之后，他提出有效可行的精子冻存方法。大量的研究表明，用冻存精液人工授精娩出的胎儿畸形率及流产率并不比正常人群高。
与精子相比，人卵母细胞的冷冻保存起步较晚。由于卵母细胞遗传物质易受外界因素的影响，所以保存比较困难。1986年，Chen[3]首次成功的冷冻保存了人卵母细胞，揭开了人卵母细胞冷冻保存的序幕。该领域的研究目前正在广泛地开展[4，5]。
2 人生殖细胞冷冻保存的原理及其损伤机制
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2.1 细胞冷冻保存的原理
人生殖细胞与其它哺乳动物细胞冷冻保存的原理基本相同。由于溶质效应，冻存的细胞在温度降至-5℃～-15℃时，首先在冻存液中形成冰晶。此时胞浆处于超冷状态(supercooling)。随着细胞外液冰晶增多，未冻结的胞浆浓度增高，化学势能也较冻结的细胞外液高，从而导致细胞进行性脱水，直至降到一定温度，细胞内才形成冰晶。因此，为避免细胞内冰晶形成所产生的致死性损伤，应设法使细胞在冰晶形成之前失去绝大部分可冻结水分。
2.2 人生殖细胞冻存损伤的机制
冷冻因素可使精子外膜和顶体膜的通透性增加或破损，引起精子内容物漏失和线粒体功能障碍，能量代谢降低[6]。冷冻对卵母细胞的损伤主要表现为透明带破裂和硬化、超微结构及染色体的损伤[7，8]。①慢速冷冻(slowing freezing)损伤：慢速冷冻过程中引起细胞损伤的主要因素是化学损伤，即溶液效应(solution effect)。过慢降温可使细胞内外电解质浓度增加，进而作用于细胞膜引发脂蛋白复合物变性和膜通透性增加。复温时导致水分大量流入细胞内，产生所谓的“渗透性休克”(osmotic shock)。②超速冷冻(ultrarapid freezing)损伤：超速冷冻主要引起细胞的物理损伤，由细胞内冰晶形成所致。由于降温速度过快，细胞内水分尚未来得及转移，从而在细胞内结冰。细胞内大量冰晶的形成会对细胞产生致死性损伤。
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3 冷冻保护剂的种类及作用机制
合理选用冷冻保护剂(cryoprotectant)在细胞的冷冻保存过程中颇为重要。众多的研究表明[9，10]，在细胞冷冻和复温过程中的适当阶段添加冷冻保护剂能有效地降低损伤。常用的冷冻保护剂主要有下列两类。
3.1 渗透型保护剂
主要包括甘油(glycerol)、二甲基亚砜(DMSO)及丙二醇(PROH)等。该类保护剂多为低分子化合物，能通过细胞膜并与水结合，从而使溶液粘性增加、细胞内冰晶形成温度显著降低(约为-40℃)。渗透型保护剂的主要保护机制可能为：①降低细胞周围未冻结液体中电解质的浓度，减少损伤。②降低细胞内水分的蒸气压，使细胞内外压趋于平衡，从而在细胞外液冻结时降低细胞皱缩的程度和速度。
值得指出的是，DMSO对包括胚胎在内的许多种细胞具有保护作用，但对人精子的保护作用较差；而甘油对人精子的保护效果十分明显。因此目前人精子的冻存常使用甘油，卵母细胞的冷冻保护剂则常选用PROH。
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3.2 非渗透型保护剂
常用的有蔗糖、蛋黄及聚乙烯吡咯酮(PVP)等。此类物质不能进入细胞，但能改变渗透压而使细胞脱水，通过减少细胞内冰晶形成发挥保护作用。蔗糖是IVF研究中最常用的非渗透型保护剂。它可使细胞在冷冻降温时发生脱水，减少细胞内冰晶形成；复温时防止水分过快进入细胞内而引起细胞过度肿胀。蛋黄内含有卵磷脂，有利于精子的获能，故其常被用于人精子的冷冻保存。近年来，Arav等[8]发现抗冷冻蛋白(antifreeze protein)可作为一种新型的冷冻保存剂。在实际操作中，常联合使用不同类型的保护剂。
关于冷冻保护剂的具体作用机制，目前尚未完全阐明。
4 人生殖细胞冷冻保存的方法
目前，精子的冷冻保存尚处于实验阶段，常用的方法有下列几种[11]：①慢速冷却/慢速复温；②慢速冷却/快速复温；③超速冷冻；④玻璃化方法。其中采用慢速冷冻时，一般应在温度降至-7℃时进行人工诱导结晶以及时启动脱水过程。此法有利于减轻细胞内冰晶形成所造成的损伤。玻璃化方法(vitrification)[12]是使用玻璃化溶液(其中保护剂成分>40%)进行细胞的冷冻保存。当温度降低时，细胞内外形成类似玻璃样的物质(并非冰晶)而起到保护作用。上述不同方法冷冻效果的优劣仍有争议。目前多数实验室采用慢速冷却/快速复温法。
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5 人生殖细胞冷冻保存在实践中的应用及展望
自从Sherman于1963年提出有效实用的人精子冻存方法后，世界上许多国家先后建立了人精子库，并广泛投入到临床实践中。10年后，世界上已有数万例用冷冻精液人工授精出生的婴儿。我国于80年代初开展了冻精人工授精的研究及应用。目前，该技术已被广泛应用于治疗男性不育、提供生殖保险等诸多方面。
卵母细胞的冷冻保存主要应用有：①保存IVF-ET中多余的卵子。②解决IVF-ET中赠者与受者体内微环境不同步的问题。③为接触毒物及放射线的女性提供生殖及优生保险。④建立“未成熟卵母细胞库”等。
由于冷冻卵母细胞的透明带易发生硬化或破损而导致体外授精率降低或多精受精，因此，近年来人们采用了一种新的显微授精技术—卵子胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)[13]。国外已有数例冷冻卵母细胞经ICSI后受孕并分娩出正常胎儿的报道[5，14]。
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综上所述，在卵母细胞冷冻保存的研究中，有两个重要的课题亟待解决。一是探寻最佳的冷冻保护剂和冻存条件，提高冷冻卵母细胞的存活率；二是冷冻卵母细胞ICSI辅助生育技术的进一步完善。这些问题的解决必将有力地推动生殖医学的发展，具有广阔的应用前景。■
作者简介：李庆雷(1970-)，男，博士研究生
参考文献：
[1]Toth TL,Baka SC,Veeck LI.Fertilization and in vitro development of cryopreserved human prophase I oocytes[J].Fetil Steril,1994,61:891.
[2]李善国，邵敬於，Tuker MJ.人卵细胞冷冻保存后经显微注射受精的初步研究[J].生殖与避孕，1996，16(1)：46.
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[3]Chen C.Pregnancy after human oocyte cryopreservation[J].Lancet,1986,1:884.
[4]Van Uem JFHM,Siebzehnrubl ER,Schuh B,et al.Birth after cryopreservation of unfertilized oocytes[J].Lancet,1987,1:752.
[5]Porcu E,Fabbri R,Seracchioli R,et al.Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes[J].Fertil Steri,1997,68(4):724.
[6]于德新，尤国才，徐正铨，等.冷冻保存的人类精子超微结构变化[J].男性学杂志，1997，9(3)：148.
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[7]Fuku E,Xia L,Downey BR.Ultrastructural changes in bovine oocytes cryopreserved by vitrification[J].Cryobiology,1995,32:139.
[8]付永伦，严敬明.人类卵母细胞的冷冻保存[J].生殖与避孕，1996，16(3)：163.
[9]Oneil L,Paynter SJ,Fuller B,et al.Vitrification of mature mouse oocytes in 6M Me2SO solution supplemented with antifreeze glycoproteins:the effect of temperature[J]Cryobiology,1998,37(1):59.
[10]Son WY,Park SE,Lee KA,et al.Effects of 1,2-propanediol and freezing-thawing on th in vitro development capacity of human immature oocytes[J].Fertil Steril,1996,66(6):995.
, 百拇医药
[11]Lassalle B,Testart J,Renard JP.Human-embryo featrues that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2-propanediol[J].Fertil Steril,1985,44:645.
[12]Rall WF,Fahy CM.Ice free cryopreservation of mouse embryos at -196℃ by vitrification[J].Nature,1985,313:573.
[13]Tucker MJ,Wright G,Morton PC.Practical evolution and application of direct intracytoplasmic sperm injection for male factor and idopathic fertilization failure infertilities[J].Fertil Steril,1995,63:820.
[14]Polak de Fried E,Notrica J,Rubinstein M,et al.Pregnancy after human donor oocyte cryopreservation and thawing in association with intracytoplasmic sperm injection in a patient with ovarian failure[J].Fertil Steril,1998,69(3):555.
收稿日期：1999-03-26, http://www.100md.com
单位：李庆雷(哈尔滨医科大学 生理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 倪江(哈尔滨医科大学 生理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：生殖细胞；冷冻保存；保护剂
哈尔滨医科大学学报000136 分类号：R321.1 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0075-02▲
随着低温生物学技术和体外受精-胚胎移植术(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)的不断发展，人精子及胚胎已被成功的冷冻保存并应用于临床实践中。目前，卵母细胞的冷冻保存虽然仍处于实验阶段[1，2]，但已有数例关于冷冻保存卵子成功受孕并分娩出健康胎儿的报道。
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1 人生殖细胞冷冻保存的简史
人精子冷冻贮存的历史可追溯到1776年，Spallanzarni发现埋于冰雪中的人精液复温后有部分精子存活。1866年Montegazza成功地在-15℃保存了人精子。Hoagland和Pricus于1942年用快速冷冻法将人精子保存于-196℃液氮中。1953年Sherman用冷冻的精子进行人工授精获得成功。10年之后，他提出有效可行的精子冻存方法。大量的研究表明，用冻存精液人工授精娩出的胎儿畸形率及流产率并不比正常人群高。
与精子相比，人卵母细胞的冷冻保存起步较晚。由于卵母细胞遗传物质易受外界因素的影响，所以保存比较困难。1986年，Chen[3]首次成功的冷冻保存了人卵母细胞，揭开了人卵母细胞冷冻保存的序幕。该领域的研究目前正在广泛地开展[4，5]。
2 人生殖细胞冷冻保存的原理及其损伤机制
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2.1 细胞冷冻保存的原理
人生殖细胞与其它哺乳动物细胞冷冻保存的原理基本相同。由于溶质效应，冻存的细胞在温度降至-5℃～-15℃时，首先在冻存液中形成冰晶。此时胞浆处于超冷状态(supercooling)。随着细胞外液冰晶增多，未冻结的胞浆浓度增高，化学势能也较冻结的细胞外液高，从而导致细胞进行性脱水，直至降到一定温度，细胞内才形成冰晶。因此，为避免细胞内冰晶形成所产生的致死性损伤，应设法使细胞在冰晶形成之前失去绝大部分可冻结水分。
2.2 人生殖细胞冻存损伤的机制
冷冻因素可使精子外膜和顶体膜的通透性增加或破损，引起精子内容物漏失和线粒体功能障碍，能量代谢降低[6]。冷冻对卵母细胞的损伤主要表现为透明带破裂和硬化、超微结构及染色体的损伤[7，8]。①慢速冷冻(slowing freezing)损伤：慢速冷冻过程中引起细胞损伤的主要因素是化学损伤，即溶液效应(solution effect)。过慢降温可使细胞内外电解质浓度增加，进而作用于细胞膜引发脂蛋白复合物变性和膜通透性增加。复温时导致水分大量流入细胞内，产生所谓的“渗透性休克”(osmotic shock)。②超速冷冻(ultrarapid freezing)损伤：超速冷冻主要引起细胞的物理损伤，由细胞内冰晶形成所致。由于降温速度过快，细胞内水分尚未来得及转移，从而在细胞内结冰。细胞内大量冰晶的形成会对细胞产生致死性损伤。
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3 冷冻保护剂的种类及作用机制
合理选用冷冻保护剂(cryoprotectant)在细胞的冷冻保存过程中颇为重要。众多的研究表明[9，10]，在细胞冷冻和复温过程中的适当阶段添加冷冻保护剂能有效地降低损伤。常用的冷冻保护剂主要有下列两类。
3.1 渗透型保护剂
主要包括甘油(glycerol)、二甲基亚砜(DMSO)及丙二醇(PROH)等。该类保护剂多为低分子化合物，能通过细胞膜并与水结合，从而使溶液粘性增加、细胞内冰晶形成温度显著降低(约为-40℃)。渗透型保护剂的主要保护机制可能为：①降低细胞周围未冻结液体中电解质的浓度，减少损伤。②降低细胞内水分的蒸气压，使细胞内外压趋于平衡，从而在细胞外液冻结时降低细胞皱缩的程度和速度。
值得指出的是，DMSO对包括胚胎在内的许多种细胞具有保护作用，但对人精子的保护作用较差；而甘油对人精子的保护效果十分明显。因此目前人精子的冻存常使用甘油，卵母细胞的冷冻保护剂则常选用PROH。
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3.2 非渗透型保护剂
常用的有蔗糖、蛋黄及聚乙烯吡咯酮(PVP)等。此类物质不能进入细胞，但能改变渗透压而使细胞脱水，通过减少细胞内冰晶形成发挥保护作用。蔗糖是IVF研究中最常用的非渗透型保护剂。它可使细胞在冷冻降温时发生脱水，减少细胞内冰晶形成；复温时防止水分过快进入细胞内而引起细胞过度肿胀。蛋黄内含有卵磷脂，有利于精子的获能，故其常被用于人精子的冷冻保存。近年来，Arav等[8]发现抗冷冻蛋白(antifreeze protein)可作为一种新型的冷冻保存剂。在实际操作中，常联合使用不同类型的保护剂。
关于冷冻保护剂的具体作用机制，目前尚未完全阐明。
4 人生殖细胞冷冻保存的方法
目前，精子的冷冻保存尚处于实验阶段，常用的方法有下列几种[11]：①慢速冷却/慢速复温；②慢速冷却/快速复温；③超速冷冻；④玻璃化方法。其中采用慢速冷冻时，一般应在温度降至-7℃时进行人工诱导结晶以及时启动脱水过程。此法有利于减轻细胞内冰晶形成所造成的损伤。玻璃化方法(vitrification)[12]是使用玻璃化溶液(其中保护剂成分>40%)进行细胞的冷冻保存。当温度降低时，细胞内外形成类似玻璃样的物质(并非冰晶)而起到保护作用。上述不同方法冷冻效果的优劣仍有争议。目前多数实验室采用慢速冷却/快速复温法。
, http://www.100md.com
5 人生殖细胞冷冻保存在实践中的应用及展望
自从Sherman于1963年提出有效实用的人精子冻存方法后，世界上许多国家先后建立了人精子库，并广泛投入到临床实践中。10年后，世界上已有数万例用冷冻精液人工授精出生的婴儿。我国于80年代初开展了冻精人工授精的研究及应用。目前，该技术已被广泛应用于治疗男性不育、提供生殖保险等诸多方面。
卵母细胞的冷冻保存主要应用有：①保存IVF-ET中多余的卵子。②解决IVF-ET中赠者与受者体内微环境不同步的问题。③为接触毒物及放射线的女性提供生殖及优生保险。④建立“未成熟卵母细胞库”等。
由于冷冻卵母细胞的透明带易发生硬化或破损而导致体外授精率降低或多精受精，因此，近年来人们采用了一种新的显微授精技术—卵子胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)[13]。国外已有数例冷冻卵母细胞经ICSI后受孕并分娩出正常胎儿的报道[5，14]。
, http://www.100md.com
综上所述，在卵母细胞冷冻保存的研究中，有两个重要的课题亟待解决。一是探寻最佳的冷冻保护剂和冻存条件，提高冷冻卵母细胞的存活率；二是冷冻卵母细胞ICSI辅助生育技术的进一步完善。这些问题的解决必将有力地推动生殖医学的发展，具有广阔的应用前景。■
作者简介：李庆雷(1970-)，男，博士研究生
参考文献：
[1]Toth TL,Baka SC,Veeck LI.Fertilization and in vitro development of cryopreserved human prophase I oocytes[J].Fetil Steril,1994,61:891.
[2]李善国，邵敬於，Tuker MJ.人卵细胞冷冻保存后经显微注射受精的初步研究[J].生殖与避孕，1996，16(1)：46.
, 百拇医药
[3]Chen C.Pregnancy after human oocyte cryopreservation[J].Lancet,1986,1:884.
[4]Van Uem JFHM,Siebzehnrubl ER,Schuh B,et al.Birth after cryopreservation of unfertilized oocytes[J].Lancet,1987,1:752.
[5]Porcu E,Fabbri R,Seracchioli R,et al.Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes[J].Fertil Steri,1997,68(4):724.
[6]于德新，尤国才，徐正铨，等.冷冻保存的人类精子超微结构变化[J].男性学杂志，1997，9(3)：148.
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[7]Fuku E,Xia L,Downey BR.Ultrastructural changes in bovine oocytes cryopreserved by vitrification[J].Cryobiology,1995,32:139.
[8]付永伦，严敬明.人类卵母细胞的冷冻保存[J].生殖与避孕，1996，16(3)：163.
[9]Oneil L,Paynter SJ,Fuller B,et al.Vitrification of mature mouse oocytes in 6M Me2SO solution supplemented with antifreeze glycoproteins:the effect of temperature[J]Cryobiology,1998,37(1):59.
[10]Son WY,Park SE,Lee KA,et al.Effects of 1,2-propanediol and freezing-thawing on th in vitro development capacity of human immature oocytes[J].Fertil Steril,1996,66(6):995.
, 百拇医药
[11]Lassalle B,Testart J,Renard JP.Human-embryo featrues that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2-propanediol[J].Fertil Steril,1985,44:645.
[12]Rall WF,Fahy CM.Ice free cryopreservation of mouse embryos at -196℃ by vitrification[J].Nature,1985,313:573.
[13]Tucker MJ,Wright G,Morton PC.Practical evolution and application of direct intracytoplasmic sperm injection for male factor and idopathic fertilization failure infertilities[J].Fertil Steril,1995,63:820.
[14]Polak de Fried E,Notrica J,Rubinstein M,et al.Pregnancy after human donor oocyte cryopreservation and thawing in association with intracytoplasmic sperm injection in a patient with ovarian failure[J].Fertil Steril,1998,69(3):555.
收稿日期：1999-03-26, http://www.100md.com