应用抑制性差减杂交技术克隆小鼠胸腺细胞发育相关新基因
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37c医学网
作者：金成刚 李燕 陈慰峰
单位：北京大学基础医学院免疫学系，北京 100083
关键词：抑制性差减杂交技术；克隆；分子；胸腺；遗传学；DNA；环状
北京医科大学学报000405 [摘 要] 目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库，结合RACE及RT-PCR进一步克隆并验证新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因，获得了差异表达的cDNA片段，克隆后挑选阳性克隆进行测序，成功克隆8个新基因片段。对其中两个新基因克隆C55和C91进行Northern杂交分析，mRNA转录体长度分别为1.4 kb及1.5 kb,C55的表达在两种胸腺基质细胞系中存在显著差异。进一步克隆了C55和C91两个新基因的cDNA全长序列，已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片段的有效方法；成功克隆8个新基因片段及两个新基因的cDNA全长序列。
, http://www.100md.com
[中图分类号] Q343.12 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0303-03
Molecular cloning of novel genes involved
in T cell development using suppression subtractive hybridization
JIN Cheng-Gang
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
LI Yan
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
CHEN Wei-Feng
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective:
To clone and characterize novel genes which might be involved in T cell development. Methods: A subtracted cDNA library of mouse thymic stromal cell lines was constructed using suppression subtractive hybridization. RACE and RT-PCR were used to clone and verify the full-length cDNAs. Results: Differentially expressed gene fragments were obtained and sequencing revealed that 8 clones represented novel gene cDNAs, including C55 and C91.Northern blot analyses of C55 and C91 showed that the mRNA transcripts were 1.4 kb and 1.5 kb, respectively. Further, the expression level of C55 mRNA was significantly different between the two thymic stromal cell lines. The full-length cDNAs of C55 and C91 have been successfully cloned and accepted by GenBank. Conclusion: suppression subtractive hybridization is an effective method to clone novel genes; Eight novel gene clones were obtained and two full-length cDNAs cloned.
, 百拇医药
KEY WORDS Suppression subtractive hybridization; Cloning, molecule; Thymus gland/genet; DNA, circular
(J Beijing Med Univ, 2000,32:303-305)
T细胞发育相关新分子和新基因的研究，有助于深入了解T细胞发育、分化和成熟的确切机制。为研究胸腺细胞与胸腺基质细胞间的相互作用，我室建立了多株胸腺基质细胞系( thymic stromal cell lines)。其中MTEC1为小鼠胸腺髓质型上皮细胞系,MTDC为小鼠胸腺树突状细胞系。体外实验证实，MTEC1具有抑制胸腺细胞凋亡的作用；而MTDC则能促进小鼠胸腺细胞的凋亡[1]。本实验应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),研究MTEC1和MTDC的差异表达基因并克隆出胸腺基质细胞的新基因。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞系和细胞培养
MTEC1及MTDC均来源于BALB/C小鼠胸腺，由我室建立，体外传代培养。培养基为DMEM(GIBCO BRL)，内含抗生素及10%(体积分数)的新生牛血清。
1.2 细胞总RNA和mRNA提取
采用GIBCOBRL公司的TRIZOLTM试剂，按实验说明进行操作，提取总RNA,溶于无RNase的水中，经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计(Beckman 640)鉴定质量后，保存于-70℃冰箱中备用。采用poly(A)Tract mRNA分离系统(Promega),获得高质量 mRNA ，用于双链cDNA合成。
1.3 双链cDNA合成
, 百拇医药
采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit中 的试剂和酶按说明操作，模板分别为MTEC1和MTDC的mRNA。
1.4 差减杂交文库的建立
采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit，原理详见文献[2]。常规SSH方法完全按说明书进行。简述如下：MTEC1和MTDC cDNA互为Driver和Tester，进行差减杂交。将Tester的cDNA分为两份，分别连接试剂 盒提供的特殊设计的寡核苷Adapter 1和Adapter 2，然后与Driver cDNA进行杂交；合并两种杂交产物后再与Driver cDNA作第2次杂交；然后将杂交产物做选择性PCR扩增，使Tester cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增。扩增产物与pT-Adv载体连接,转化TOP10’菌，进行克隆化，然后提取重组质粒DNA进行测序。 测得序列,利用Internet进入GenBank数据库进行同源性比较和分析。
, 百拇医药
1.5 Northern blotting杂交分析
将序列分析后显示可能来自新基因的cDNA片段 C55和C91进行32P标记作成标记探针，用MTEC1和MTDC的总RNA进行Northern杂交分析。Hybond-C硝酸纤维膜为Amersham Life Service 公司产品，按分子克隆进行操作[3]。
2 结果
2.1 差减杂交文库的建立
常规SSH完全按说明书进行，杂交产物经PCR扩增后，经凝胶电泳，显示条带，这些差异条带可能代表差异表达的基因片段(图1)。
1， DNA marker; 2， tester: MTDC, driver:MTEC1;
, http://www.100md.com
3， tester:MTEC1, Driver：MTDC.
图1 差减杂交PCR产物电泳图
Figure 1 Electrophoresis of PCR products after
subtractive hybridization
2.2 阳性cDNA克隆的分离和序列分析
对采用SSH方法杂交后PCR产物克隆化，经DNA测序，与GenBank数据库进行同源性比较。结果发现，在所测的序列中，8个cDNA克隆为小鼠未知的新基因的片段；5个cDNA克隆与猪或大鼠相关的基因高度同源，但在小鼠中尚未克隆成功；7个cDNA克隆为小鼠已知的基因片段(表1)。
表1 阳性克隆测序及GenBank同源序列比较结果
, http://www.100md.com
Table 1 Sequencing and GenBank homology search of positive clones Clones
Homology
Percentage
Size(bp)
Tester
C22
M.BGAL
95
386
MTDC
C24
, 百拇医药
M.Lama5
94
378
MTDC
C26
unknown
-
156
MTDC
C27
M.γ-actin
98
259
, http://www.100md.com
MTDC
C29
M.A-X actin
91
287
MTDC
C32
unknown
-
87
MTDC
C33
unknown
, 百拇医药
-
222
MTDC
C35
M.SYT
95
363
MTDC
C40
unknown
-
148
MTDC
, 百拇医药
C49
unknown
-
473
MTDC
C52
R.L27
95
279
METC1
C54
R.L27
95
, 百拇医药
270
METC1
C55
unknown
-
200
METC1
C61
R. Clone Ch4A-RC5
94
380
METC1
C62
, 百拇医药
R. Clone Ch4A-RC5
96
284
METC1
C72
P. endopeptidase
96
311
MTDC
C78
unknown
-
386
, 百拇医药
MTDC
C91
unknown
-
452
MTDC
C98
M.Rab11b
99
377
MTDC
C102
M.sid23p
, http://www.100md.com
97
297
MTDC
2.3 Northern blotting杂交分析
对两个新基因克隆C55(Tester为MTEC1)和C91(Tester为MTDC)进行Northern blot 杂交分析。结果发现,基因C55 mRNA转录本约为1.4 kb，其在MTEC1中表达明显高于MTDC;而C91 mRNA转录约为1.5 kb,在两种相关的胸腺基质细胞系中表达无明显差异(图2)。
图2 Northern blot 杂交分析基因C91和C55的表达
Figure 2 Northern blot analysis of C91
, http://www.100md.com
and C55 mRNA expression
2.4 基因C55和C91 cDNA全长序列克隆
采用RACE和RT-PCR等分子克隆方法，成功克隆了两个新基因C55和C91 cDNA全长序列。C55为小鼠Transgelin家族新成员；C91基因编码一个含31个氨基酸信号肽的未知蛋白质。计算机蛋白功能分析，提示可能为一新型跨膜分子。两新基因均被美国GenBank接收，登录号分别为AF116911和AF149291。
3 讨论
cDNA差减杂交是分离、确定差异表达基因的有效手段[4]。目前广泛应用的克隆差异表达基因的技术包括 DD-PCR(differential display PCR),RDA(representational difference analysis)以及SSH[5，6],DD-PCR扩增代表性mRNA中所有片段,而RDA排除两个细胞群中的共有基因片段， 仅扩增差异表达基因片段，但两种方法的假阳性率较高，且有利于扩增高丰度mRNA基因片段，而低丰度mRNA基因片段却得不到相应的扩增。
, 百拇医药
SSH方法只能获得差异显示的cDNA片段，其长度介于100～800 bp之间，常见者为100～250 bp。为获得基因全长，需行RACE扩增，即向5′-及3′-端延伸，直至全长基因，对此基因全长，尚需经Northern杂交验证，应用这些方法，我们获得8个小鼠新基因片段的克隆。对其中两个片段进一步进行全长cDNA克隆，已成功克隆两个新基因cDNA全长序列，GenBank登录号分别为AF116911和AF149291(另文报道)。新基因的功能正在研究之中。
基金项目：国家自然科学基金(39730410)；
参考文献
1，董海东，庞学文，陈慰峰.两种胸腺基质制细胞对胸腺细胞程序性死亡的不同作用[J].中华微生物和免疫学杂志，1996，16(4)；284-288
2，Luda D, Yan-Fai CL, Aaron PC, et al. Suppression subtractive hybridization :a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:6025-6030
, 百拇医药
3，萨幕布鲁克J,费里奇EF,曼尼阿蒂斯T,著.分子克隆试验指南[M]，第2版.北京：北京科学出版社，1992.28
4，Lisitsyn N, Lisitsyn N, Wigler M. Cloning the differences between two complex genomes[J]. Science， 1993,259:948-951
5，Hubank M, Schatz DG. Identifying in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA[J]. Nucleic Acids Res, 1994,22(25):5640-5648
6，Kuang WW, Thompson DA, Hoch RV, et al. Differential screening and suppression subtractive hybridization identified genes differentially expressed in an estrogen receptor-positive breast carcinoma cell line[J]. Nucleic Acid Res， 1998,26(4):1116-1123
(2000-06-09收稿), 百拇医药
单位：北京大学基础医学院免疫学系，北京 100083
关键词：抑制性差减杂交技术；克隆；分子；胸腺；遗传学；DNA；环状
北京医科大学学报000405 [摘 要] 目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库，结合RACE及RT-PCR进一步克隆并验证新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因，获得了差异表达的cDNA片段，克隆后挑选阳性克隆进行测序，成功克隆8个新基因片段。对其中两个新基因克隆C55和C91进行Northern杂交分析，mRNA转录体长度分别为1.4 kb及1.5 kb,C55的表达在两种胸腺基质细胞系中存在显著差异。进一步克隆了C55和C91两个新基因的cDNA全长序列，已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片段的有效方法；成功克隆8个新基因片段及两个新基因的cDNA全长序列。
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[中图分类号] Q343.12 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0303-03
Molecular cloning of novel genes involved
in T cell development using suppression subtractive hybridization
JIN Cheng-Gang
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
LI Yan
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
CHEN Wei-Feng
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective:
To clone and characterize novel genes which might be involved in T cell development. Methods: A subtracted cDNA library of mouse thymic stromal cell lines was constructed using suppression subtractive hybridization. RACE and RT-PCR were used to clone and verify the full-length cDNAs. Results: Differentially expressed gene fragments were obtained and sequencing revealed that 8 clones represented novel gene cDNAs, including C55 and C91.Northern blot analyses of C55 and C91 showed that the mRNA transcripts were 1.4 kb and 1.5 kb, respectively. Further, the expression level of C55 mRNA was significantly different between the two thymic stromal cell lines. The full-length cDNAs of C55 and C91 have been successfully cloned and accepted by GenBank. Conclusion: suppression subtractive hybridization is an effective method to clone novel genes; Eight novel gene clones were obtained and two full-length cDNAs cloned.
, 百拇医药
KEY WORDS Suppression subtractive hybridization; Cloning, molecule; Thymus gland/genet; DNA, circular
(J Beijing Med Univ, 2000,32:303-305)
T细胞发育相关新分子和新基因的研究，有助于深入了解T细胞发育、分化和成熟的确切机制。为研究胸腺细胞与胸腺基质细胞间的相互作用，我室建立了多株胸腺基质细胞系( thymic stromal cell lines)。其中MTEC1为小鼠胸腺髓质型上皮细胞系,MTDC为小鼠胸腺树突状细胞系。体外实验证实，MTEC1具有抑制胸腺细胞凋亡的作用；而MTDC则能促进小鼠胸腺细胞的凋亡[1]。本实验应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),研究MTEC1和MTDC的差异表达基因并克隆出胸腺基质细胞的新基因。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞系和细胞培养
MTEC1及MTDC均来源于BALB/C小鼠胸腺，由我室建立，体外传代培养。培养基为DMEM(GIBCO BRL)，内含抗生素及10%(体积分数)的新生牛血清。
1.2 细胞总RNA和mRNA提取
采用GIBCOBRL公司的TRIZOLTM试剂，按实验说明进行操作，提取总RNA,溶于无RNase的水中，经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计(Beckman 640)鉴定质量后，保存于-70℃冰箱中备用。采用poly(A)Tract mRNA分离系统(Promega),获得高质量 mRNA ，用于双链cDNA合成。
1.3 双链cDNA合成
, 百拇医药
采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit中 的试剂和酶按说明操作，模板分别为MTEC1和MTDC的mRNA。
1.4 差减杂交文库的建立
采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit，原理详见文献[2]。常规SSH方法完全按说明书进行。简述如下：MTEC1和MTDC cDNA互为Driver和Tester，进行差减杂交。将Tester的cDNA分为两份，分别连接试剂 盒提供的特殊设计的寡核苷Adapter 1和Adapter 2，然后与Driver cDNA进行杂交；合并两种杂交产物后再与Driver cDNA作第2次杂交；然后将杂交产物做选择性PCR扩增，使Tester cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增。扩增产物与pT-Adv载体连接,转化TOP10’菌，进行克隆化，然后提取重组质粒DNA进行测序。 测得序列,利用Internet进入GenBank数据库进行同源性比较和分析。
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1.5 Northern blotting杂交分析
将序列分析后显示可能来自新基因的cDNA片段 C55和C91进行32P标记作成标记探针，用MTEC1和MTDC的总RNA进行Northern杂交分析。Hybond-C硝酸纤维膜为Amersham Life Service 公司产品，按分子克隆进行操作[3]。
2 结果
2.1 差减杂交文库的建立
常规SSH完全按说明书进行，杂交产物经PCR扩增后，经凝胶电泳，显示条带，这些差异条带可能代表差异表达的基因片段(图1)。
1， DNA marker; 2， tester: MTDC, driver:MTEC1;
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3， tester:MTEC1, Driver：MTDC.
图1 差减杂交PCR产物电泳图
Figure 1 Electrophoresis of PCR products after
subtractive hybridization
2.2 阳性cDNA克隆的分离和序列分析
对采用SSH方法杂交后PCR产物克隆化，经DNA测序，与GenBank数据库进行同源性比较。结果发现，在所测的序列中，8个cDNA克隆为小鼠未知的新基因的片段；5个cDNA克隆与猪或大鼠相关的基因高度同源，但在小鼠中尚未克隆成功；7个cDNA克隆为小鼠已知的基因片段(表1)。
表1 阳性克隆测序及GenBank同源序列比较结果
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Table 1 Sequencing and GenBank homology search of positive clones Clones
Homology
Percentage
Size(bp)
Tester
C22
M.BGAL
95
386
MTDC
C24
, 百拇医药
M.Lama5
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378
MTDC
C26
unknown
-
156
MTDC
C27
M.γ-actin
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MTDC
C29
M.A-X actin
91
287
MTDC
C32
unknown
-
87
MTDC
C33
unknown
, 百拇医药
-
222
MTDC
C35
M.SYT
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MTDC
C40
unknown
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148
MTDC
, 百拇医药
C49
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473
MTDC
C52
R.L27
95
279
METC1
C54
R.L27
95
, 百拇医药
270
METC1
C55
unknown
-
200
METC1
C61
R. Clone Ch4A-RC5
94
380
METC1
C62
, 百拇医药
R. Clone Ch4A-RC5
96
284
METC1
C72
P. endopeptidase
96
311
MTDC
C78
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386
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MTDC
C91
unknown
-
452
MTDC
C98
M.Rab11b
99
377
MTDC
C102
M.sid23p
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97
297
MTDC
2.3 Northern blotting杂交分析
对两个新基因克隆C55(Tester为MTEC1)和C91(Tester为MTDC)进行Northern blot 杂交分析。结果发现,基因C55 mRNA转录本约为1.4 kb，其在MTEC1中表达明显高于MTDC;而C91 mRNA转录约为1.5 kb,在两种相关的胸腺基质细胞系中表达无明显差异(图2)。
图2 Northern blot 杂交分析基因C91和C55的表达
Figure 2 Northern blot analysis of C91
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and C55 mRNA expression
2.4 基因C55和C91 cDNA全长序列克隆
采用RACE和RT-PCR等分子克隆方法，成功克隆了两个新基因C55和C91 cDNA全长序列。C55为小鼠Transgelin家族新成员；C91基因编码一个含31个氨基酸信号肽的未知蛋白质。计算机蛋白功能分析，提示可能为一新型跨膜分子。两新基因均被美国GenBank接收，登录号分别为AF116911和AF149291。
3 讨论
cDNA差减杂交是分离、确定差异表达基因的有效手段[4]。目前广泛应用的克隆差异表达基因的技术包括 DD-PCR(differential display PCR),RDA(representational difference analysis)以及SSH[5，6],DD-PCR扩增代表性mRNA中所有片段,而RDA排除两个细胞群中的共有基因片段， 仅扩增差异表达基因片段，但两种方法的假阳性率较高，且有利于扩增高丰度mRNA基因片段，而低丰度mRNA基因片段却得不到相应的扩增。
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SSH方法只能获得差异显示的cDNA片段，其长度介于100～800 bp之间，常见者为100～250 bp。为获得基因全长，需行RACE扩增，即向5′-及3′-端延伸，直至全长基因，对此基因全长，尚需经Northern杂交验证，应用这些方法，我们获得8个小鼠新基因片段的克隆。对其中两个片段进一步进行全长cDNA克隆，已成功克隆两个新基因cDNA全长序列，GenBank登录号分别为AF116911和AF149291(另文报道)。新基因的功能正在研究之中。
基金项目：国家自然科学基金(39730410)；
参考文献
1，董海东，庞学文，陈慰峰.两种胸腺基质制细胞对胸腺细胞程序性死亡的不同作用[J].中华微生物和免疫学杂志，1996，16(4)；284-288
2，Luda D, Yan-Fai CL, Aaron PC, et al. Suppression subtractive hybridization :a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:6025-6030
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3，萨幕布鲁克J,费里奇EF,曼尼阿蒂斯T,著.分子克隆试验指南[M]，第2版.北京：北京科学出版社，1992.28
4，Lisitsyn N, Lisitsyn N, Wigler M. Cloning the differences between two complex genomes[J]. Science， 1993,259:948-951
5，Hubank M, Schatz DG. Identifying in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA[J]. Nucleic Acids Res, 1994,22(25):5640-5648
6，Kuang WW, Thompson DA, Hoch RV, et al. Differential screening and suppression subtractive hybridization identified genes differentially expressed in an estrogen receptor-positive breast carcinoma cell line[J]. Nucleic Acid Res， 1998,26(4):1116-1123
(2000-06-09收稿), 百拇医药