大鼠甲状腺毒症心肌肥大的ATP酶研究
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作者：姜平 刘正清 文建亚
单位：湖南医科大学心血管形态学研究室 长沙 410078
关键词：甲状腺毒症心肌肥大；ATP酶；大鼠
中国现代医学杂志000351分类号 R-332
本文在建立甲状腺毒症心肌肥大动物模型的基础上，应用组化方法和图像分析对心肌的ATP酶进行定性和定量的研究。
1 材料与方法
1.1 动物模型
24只160～200g的Wistar大鼠，随机分为四组，两组为实验组，两组为对照组。实验组行腹腔注射L型甲状腺素(1.0/kg/次/d)，分别在注射2周、3周后处死，对照组注射0.9%NaCl(0.5ml/次/d)在相对应的时间处死。
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1.2 标本处理
各组动物在实验前称重，测定基础体重，在预定时间处死前再称量，并测定大鼠心率及尾动脉压。2%戊巴比妥钠(3～4mg/100g体重)作腹腔麻醉，开胸后迅速从左室抽吸血液1～2ml(迅速离心，提取上层血清，用放射性同位素测定T的浓度)，随后左室注射10%KCl，使心跳停于舒张期，紧贴各大血管根部剪下心脏称全心重，取左心室游离前壁心外膜下层心肌一部分作HE染色，测定心肌细胞直径，另一部分作冰冻切片，用于ATP酶活性变化研究。
1.3 ATP酶定性观察
Waechstein-Meisel铅法：用AO恒低温切片机将大鼠左心室切成10～12μm切片(-20℃)，在37℃温箱中孵育2～3h,孵育液：ATP钠盐0.125%10ml，0.2M三(羟甲基)氨基甲烷，顺丁稀二酸缓冲液(pH7.2)10ml；2%硝酸铜1.5ml；2.5%硫酸镁2.5ml；蒸馏水1ml，1%硫化胺显色1min。此以Mg作激活剂，主要显示质膜、线粒体ATP酶，结果呈棕褐色。
, 百拇医药
Padykula-Herman钙铅法：在37℃温箱中孵育2～4h，孵育液：ATP钠盐300mg；0.1M巴比妥钠20ml；0.1M氯化钴10ml；蒸馏水10ml；pH9.4(用0.1N NaOH调整)。入1%硫化铵1～2min。此以钙离子作为激活剂，主要显示肌球蛋白ATP酶，结果呈灰褐色。
1.4 ATP酶定量分析
每个左室切5张切片，每张切片随机测定两个ATP酶的活性区，用IBAS图象分析系统进行测定，透过率的灰度从0～255，透过率的大小反应酶反应产物的多少。ATP酶活性区颜色越深，代表ATP酶活性愈高，透过率小。反之，则透过率大。
1.5 统计学处理
所有资料均采用t检验，所有数据均为平均值±标准误(Mean±SER)。
2 结果
, 百拇医药
2.1 实验组心率明显增快，血压升高。T浓度增高。全心重/体重比值显著升高，心肌纤维直径增加(P<0.01)(表1)，这表明心肌发生了肥大。
表1 各组大体参数比较表(
±s) 组别
C1
E1
C2
E2
n=6
n=6
n=6
, 百拇医药
n=6
心率(T/min)
289.2±7.1007
366.7001)±5.8878
313.7000±7.6748
472.30001)±7.4417
血压(mmHg)
105.0±3.9273
158.7001)±2.8681
110.3000±4.3361
, 百拇医药
166.5000±5.2585
T4(μg/dl)
7.1±1.9331
45.5001)±2.3188
9.1000±1.2139
50.30001)±1.8321
全心重/体重(mg/g)
2.7345±0.2078
4.6211)±0.2907
2.8436±0.3211
, 百拇医药
4.89201)±0.1032
心肌纤维直径(μ)
12.4±1.5100
14.6001)±1.5300
12.8000±1.5100
16.80001)±1.6200
注：1)实验组与对照组比较P<0.01
2.2 ATP酶活性变化
光镜下观察，各组去底物孵育无反应物颗粒存在。阳性结果中，实验组反应物颜色明显深于对照组，透过率则小于对照组(表2)。
, 百拇医药
表2 各组ATP酶反应物透过率(T%) 组别
C1
E1
C2
E2
n=6
n=6
n=6
n=6
W-M法
32.1574±3.6821
27.55161)±6.9252
, 百拇医药
31.7863±5.0384
25.33631)±4.0564
P-HI法
25.0124±3.2457
21.13461)±4.0244
26.3638±1.6475
18.96321)±2.7731
注：1) 实验组与对照组比较P<0.01
3 讨论
目前造成心肌肥大的方法有许多种，行腹腔注射甲状腺素造成心肌肥大仍是一种较为理想和便捷的方法。本实验通过腹腔注射甲状腺素，建立了心肌肥大的动物模型。
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过量的甲状腺素作用于β-肾上腺素能受体，激活腺苷酸环化酶或直接作用于腺苷酸环化酶系统并能提高儿茶酚胺的敏感性，使心肌贮备力量动员起来，心肌组织、细胞的超微结构随之发生改变，导致心肌肥大的发生。文献报道，给甲状腺素3d后，心肌代谢增加，7d后，合成蛋白比对照组多8%，代谢增强更明显，根据Meerson关于心肌肥大三个阶段的理论，心肌肥大分为三期：肥大发生期；代偿性肥厚期；心衰期。我们的结果显示ATP酶活性增强，可能是心肌肥大发生时，ATP需要量和蛋白质合成量增加，因而可能为肥大发生时的代偿反应。
参考文献：
1 李广生，王 凡.心肌病理学，上海：上海科技出版社，1985
2 Symons C,et al.The production of cardiac hypertrophy by tri-iodo-thyroacetic acid J. Endocrinlol, 1975, 63(3):341～346
3 Fagg C et al.Synthesis and Degradation of myocardial protein during the development and regression of Thyroxine induced cardiac hypertrophy in rats, Cire Res, 1978;43(5):688～693
4 Meeson F Z.Insufficiency of hypertrophied heart, Basic Res Cardial 1976;71:343～352
(1999-02-17收稿), http://www.100md.com
单位：湖南医科大学心血管形态学研究室 长沙 410078
关键词：甲状腺毒症心肌肥大；ATP酶；大鼠
中国现代医学杂志000351分类号 R-332
本文在建立甲状腺毒症心肌肥大动物模型的基础上，应用组化方法和图像分析对心肌的ATP酶进行定性和定量的研究。
1 材料与方法
1.1 动物模型
24只160～200g的Wistar大鼠，随机分为四组，两组为实验组，两组为对照组。实验组行腹腔注射L型甲状腺素(1.0/kg/次/d)，分别在注射2周、3周后处死，对照组注射0.9%NaCl(0.5ml/次/d)在相对应的时间处死。
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1.2 标本处理
各组动物在实验前称重，测定基础体重，在预定时间处死前再称量，并测定大鼠心率及尾动脉压。2%戊巴比妥钠(3～4mg/100g体重)作腹腔麻醉，开胸后迅速从左室抽吸血液1～2ml(迅速离心，提取上层血清，用放射性同位素测定T的浓度)，随后左室注射10%KCl，使心跳停于舒张期，紧贴各大血管根部剪下心脏称全心重，取左心室游离前壁心外膜下层心肌一部分作HE染色，测定心肌细胞直径，另一部分作冰冻切片，用于ATP酶活性变化研究。
1.3 ATP酶定性观察
Waechstein-Meisel铅法：用AO恒低温切片机将大鼠左心室切成10～12μm切片(-20℃)，在37℃温箱中孵育2～3h,孵育液：ATP钠盐0.125%10ml，0.2M三(羟甲基)氨基甲烷，顺丁稀二酸缓冲液(pH7.2)10ml；2%硝酸铜1.5ml；2.5%硫酸镁2.5ml；蒸馏水1ml，1%硫化胺显色1min。此以Mg作激活剂，主要显示质膜、线粒体ATP酶，结果呈棕褐色。
, 百拇医药
Padykula-Herman钙铅法：在37℃温箱中孵育2～4h，孵育液：ATP钠盐300mg；0.1M巴比妥钠20ml；0.1M氯化钴10ml；蒸馏水10ml；pH9.4(用0.1N NaOH调整)。入1%硫化铵1～2min。此以钙离子作为激活剂，主要显示肌球蛋白ATP酶，结果呈灰褐色。
1.4 ATP酶定量分析
每个左室切5张切片，每张切片随机测定两个ATP酶的活性区，用IBAS图象分析系统进行测定，透过率的灰度从0～255，透过率的大小反应酶反应产物的多少。ATP酶活性区颜色越深，代表ATP酶活性愈高，透过率小。反之，则透过率大。
1.5 统计学处理
所有资料均采用t检验，所有数据均为平均值±标准误(Mean±SER)。
2 结果
, 百拇医药
2.1 实验组心率明显增快，血压升高。T浓度增高。全心重/体重比值显著升高，心肌纤维直径增加(P<0.01)(表1)，这表明心肌发生了肥大。
表1 各组大体参数比较表(
±s) 组别C1
E1
C2
E2
n=6
n=6
n=6
, 百拇医药
n=6
心率(T/min)
289.2±7.1007
366.7001)±5.8878
313.7000±7.6748
472.30001)±7.4417
血压(mmHg)
105.0±3.9273
158.7001)±2.8681
110.3000±4.3361
, 百拇医药
166.5000±5.2585
T4(μg/dl)
7.1±1.9331
45.5001)±2.3188
9.1000±1.2139
50.30001)±1.8321
全心重/体重(mg/g)
2.7345±0.2078
4.6211)±0.2907
2.8436±0.3211
, 百拇医药
4.89201)±0.1032
心肌纤维直径(μ)
12.4±1.5100
14.6001)±1.5300
12.8000±1.5100
16.80001)±1.6200
注：1)实验组与对照组比较P<0.01
2.2 ATP酶活性变化
光镜下观察，各组去底物孵育无反应物颗粒存在。阳性结果中，实验组反应物颜色明显深于对照组，透过率则小于对照组(表2)。
, 百拇医药
表2 各组ATP酶反应物透过率(T%) 组别
C1
E1
C2
E2
n=6
n=6
n=6
n=6
W-M法
32.1574±3.6821
27.55161)±6.9252
, 百拇医药
31.7863±5.0384
25.33631)±4.0564
P-HI法
25.0124±3.2457
21.13461)±4.0244
26.3638±1.6475
18.96321)±2.7731
注：1) 实验组与对照组比较P<0.01
3 讨论
目前造成心肌肥大的方法有许多种，行腹腔注射甲状腺素造成心肌肥大仍是一种较为理想和便捷的方法。本实验通过腹腔注射甲状腺素，建立了心肌肥大的动物模型。
, http://www.100md.com
过量的甲状腺素作用于β-肾上腺素能受体，激活腺苷酸环化酶或直接作用于腺苷酸环化酶系统并能提高儿茶酚胺的敏感性，使心肌贮备力量动员起来，心肌组织、细胞的超微结构随之发生改变，导致心肌肥大的发生。文献报道，给甲状腺素3d后，心肌代谢增加，7d后，合成蛋白比对照组多8%，代谢增强更明显，根据Meerson关于心肌肥大三个阶段的理论，心肌肥大分为三期：肥大发生期；代偿性肥厚期；心衰期。我们的结果显示ATP酶活性增强，可能是心肌肥大发生时，ATP需要量和蛋白质合成量增加，因而可能为肥大发生时的代偿反应。
参考文献：
1 李广生，王 凡.心肌病理学，上海：上海科技出版社，1985
2 Symons C,et al.The production of cardiac hypertrophy by tri-iodo-thyroacetic acid J. Endocrinlol, 1975, 63(3):341～346
3 Fagg C et al.Synthesis and Degradation of myocardial protein during the development and regression of Thyroxine induced cardiac hypertrophy in rats, Cire Res, 1978;43(5):688～693
4 Meeson F Z.Insufficiency of hypertrophied heart, Basic Res Cardial 1976;71:343～352
(1999-02-17收稿), http://www.100md.com