5-氮-2′-脱氧胞嘧啶诱导Molt4细胞系p15基因表达的研究
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作者：金哈斯 楼方定 于力 王全顺 史子江
单位：100853 北京，解放军总医院
关键词：
中华血液学杂志000616 大量的研究证明，p15基因的启动子CpG岛甲基化以后可抑制其基因的表达，导致白血病及其它肿瘤的发生[1]。我们研究了去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞嘧啶(5-aza-deoxycytidine,CdR)作用于急性淋巴细胞白血病细胞后p15基因的表达，以及其对细胞生长、细胞周期的影响。
材料和方法
1 材料 CdR购自美国Sigma公司，用含氯化钠的磷酸缓冲液(pH6.8)配制成储备液，-80℃保存。应用终浓度为25μmol/L。MLV、Trizol Wizard DNA树酯纯化柱均为Promega公司产品，蛋白酶K为Merco公司产品，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)引物由赛百盛公司合成，MSP引物由上海生物工程公司合成。流式细胞仪为美国Becton Kickinson Facscahbur公司产品。Molt4细胞为急性T淋巴细胞白血病模型，由中国医学科学院肿瘤研究所提供。
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2 细胞培养 Molt 4细胞常规置于24孔培养板，培养于体积分数为10%的热灭活胎牛血清RPMI 1640液中(37℃，的体积分数为5%的CO2)，实验用细胞均处在对数生长期。
3 细胞生长曲线的测定 Molt4细胞在37℃，体积分数为5%的CO2条件下，按1×105/ml的起始浓度培养于上述培养液内，每天加入药物并以台盼蓝拒染法作活细胞计数。
4 细胞周期分析 细胞经不同浓度CdR孵育不同时间后，PBS清洗2次，加入冷乙醇4℃固定24h以上。随后以PBS清洗细胞，与含1%RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)37℃共同孵育30min，用碘化丙锭(100μg/ml)进行DNA染色，避光30min，用流式细胞仪检测细胞周期百分率。
5 p15基因甲基化的测定 用常规方法提取细胞DNA。取DNA 2μg，加NaOH(终浓度为0.2mol/L)，37℃ 10min 后加入新鲜配制的10mmol/L氢醌30μl和30mol/L亚硫酸氢钠520μl，加石蜡油50℃孵育16h ,修饰的DNA用Wizard 纯化柱纯化并洗脱在50μl水中，再加入NaOH(终浓度为0.3mol/L)，10min后用乙醇沉淀，得到的DNA立即应用或-20℃保存。p15甲基化引物(p15M)：有义链：5′-GCGTTCGTATTTTGCGGTT-3′；反义链：5′-CGTACAATAACCGAACGAACGACCGA-3′，扩增产物为148bp。p15非甲基化引物(p15U):有义链：5′-TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT-3′；反义链：5′-CCATACAATAACCAAACAACCAA-3，扩增产物为154bp。25μl反应体系包括10×缓冲液，6.7mmol MgCl2，dNTP每管1.25mmol,引物150ng，硫化后DNA 25ng。95℃预变性5min后加Taq酶，PCR条件为：95℃ 30s,60℃ 30s,35个循环，72℃延伸4min。于20g/L琼脂糖凝胶上电泳，数码相机照相。
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6 p15基因的测定 用Trizol试剂盒提取细胞RNA后测吸光度(A)值或电泳鉴定其质量。RT反应液包括5×缓冲液，MLV 200U/μl，dNTP 2.5mmol,RNAsin 40U/μl,Oligodt 1μl,RNA 2μl,总体系为20μl。RT-PCR引物：p15引物1：5′-CCAGAAGCAATCCAGGCACG-3′;p15引物2：5′-CGTTGGCAGCCTTCATCG-3′，扩增产物为715bp。β-actin引物1 :5′-CCAAGGCCAACCGCCAGAAGATGA-3′；β-actin引物2：5′-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3′，扩增产物为583bp。25μl PCR体系含10×缓冲液，2.5mmol dNTP,150ng p15引物1，150ng p15引物2，200ng,Actin引物1,200ng Actin引物2,cDNA 3.0μl，2.0μl Taq酶。PCR条件：95℃预变性2min,95℃变性30s,60℃退火1min,72℃延伸1min,30个循环，72℃延伸7min。
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7 统计学处理 t检验。
结果
1 CdR对Molt 4 细胞生长的影响 CdR对Molt4细胞生长有明显的抑制作用，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)， Molt4细胞倍增时间显著延长(P<0.05)(图1)。
图1 CdR对Molt4细胞生长的影响
2 CdR对细胞周期的影响 不同浓度的CdR作用 Molt4细胞后G0/G1期细胞明显增加，与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.01)(表1)。
表1 不同浓度的CdR对Molt4细胞周期的影响(%，
±s) 组别
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G0/G1期细胞
G2/M期细胞
S期细胞
CdR 25μmol/L
51.07±1.15
4.03±0.47
43.23±1.22
CdR 50μmol/L
60.93±0.98
3.47±0.29
37.86±1.07
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对照组
20.6±0.64
13.15±0.70
61.09±1.81
3 Molt4细胞p15基因甲基化 Molt4细胞p15基因甲基化引物PCR阳性，未甲基化引物阴性，而U937细胞甲基化引物PCR阴性，而未甲基化引物阳性(图2)。
图2 Molt4细胞p15基因甲基化
4 CdR对细胞p15基因表达的影响 25μmol/L及50μmol/L CdR处理96h后，测定p15基因mRNA的表达，结果用药组表达强阳性，未用药组弱表达或不表达，半定量分析用药组与未用药组差异有显著性意义(P<0.01)，但两个剂量组之间差异不明显(图3)。
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图3 Molt4细胞 p15基因表达
讨论
CpG岛的甲基化常发生在肿瘤抑制基因启动子，灭活启动子功能，使肿瘤抑制基因不能够表达，导致白血病。我们用甲基化特异的PCR检测Molt 4细胞的甲基化，甲基化修饰只发生于5′～3′方向CG相联的C上，因此在亚硫酸氢钠作用后，DNA若无甲基化，则序列中的改变为C变为U，若有甲基化则C不会改变，用不同的引物进行PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛的甲基化。MSP对引物的设计有特殊要求，由于设计了甲基化引物M与非甲基化引物U，二者中至少有一个扩增 ，这样无需设定内参照。我们用MSP方法测定了Molt 4细胞p15基因甲基化，U937细胞作为对照，用p15基因甲基化的Molt4细胞作为去甲基化研究对象。
CdR的作用原理是抑制甲基转移酶活性，在分裂细胞DNA复制过程中，甲基不能够转移到胞嘧啶上，起去甲基化作用[2]。我们将p15基因甲基化的Molt 4细胞与CdR一起培养96h后用RT-PCR方法测定p15基因表达，结果p15基因重新表达，说明CdR使p15基因去甲基化。
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流式细胞仪检测结果表明CdR处理的细胞G0/G1期细胞明显增加，说明CdR通过p15基因去甲基化，激活p15基因mRNA表达，恢复了对细胞周期负调节功能，抑制细胞增殖。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970318)
参考文献
1，Issa JPJ,Baylin SB,Herman JG.DNA methylation changes in hematologic malignancies:biologic and clinical implications.Leukemia,1997,11:s7-11.
2，Bender CM,Pao MM,Jones PA.Inhibition of DNA methylation by 5-aza-2-deoxycytidine suppresses the growth of human tumor cell lines.Cancer Res ,1998,58:95-101.
(收稿日期：1999-11-26), http://www.100md.com
单位：100853 北京，解放军总医院
关键词：
中华血液学杂志000616 大量的研究证明，p15基因的启动子CpG岛甲基化以后可抑制其基因的表达，导致白血病及其它肿瘤的发生[1]。我们研究了去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞嘧啶(5-aza-deoxycytidine,CdR)作用于急性淋巴细胞白血病细胞后p15基因的表达，以及其对细胞生长、细胞周期的影响。
材料和方法
1 材料 CdR购自美国Sigma公司，用含氯化钠的磷酸缓冲液(pH6.8)配制成储备液，-80℃保存。应用终浓度为25μmol/L。MLV、Trizol Wizard DNA树酯纯化柱均为Promega公司产品，蛋白酶K为Merco公司产品，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)引物由赛百盛公司合成，MSP引物由上海生物工程公司合成。流式细胞仪为美国Becton Kickinson Facscahbur公司产品。Molt4细胞为急性T淋巴细胞白血病模型，由中国医学科学院肿瘤研究所提供。
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2 细胞培养 Molt 4细胞常规置于24孔培养板，培养于体积分数为10%的热灭活胎牛血清RPMI 1640液中(37℃，的体积分数为5%的CO2)，实验用细胞均处在对数生长期。
3 细胞生长曲线的测定 Molt4细胞在37℃，体积分数为5%的CO2条件下，按1×105/ml的起始浓度培养于上述培养液内，每天加入药物并以台盼蓝拒染法作活细胞计数。
4 细胞周期分析 细胞经不同浓度CdR孵育不同时间后，PBS清洗2次，加入冷乙醇4℃固定24h以上。随后以PBS清洗细胞，与含1%RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)37℃共同孵育30min，用碘化丙锭(100μg/ml)进行DNA染色，避光30min，用流式细胞仪检测细胞周期百分率。
5 p15基因甲基化的测定 用常规方法提取细胞DNA。取DNA 2μg，加NaOH(终浓度为0.2mol/L)，37℃ 10min 后加入新鲜配制的10mmol/L氢醌30μl和30mol/L亚硫酸氢钠520μl，加石蜡油50℃孵育16h ,修饰的DNA用Wizard 纯化柱纯化并洗脱在50μl水中，再加入NaOH(终浓度为0.3mol/L)，10min后用乙醇沉淀，得到的DNA立即应用或-20℃保存。p15甲基化引物(p15M)：有义链：5′-GCGTTCGTATTTTGCGGTT-3′；反义链：5′-CGTACAATAACCGAACGAACGACCGA-3′，扩增产物为148bp。p15非甲基化引物(p15U):有义链：5′-TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT-3′；反义链：5′-CCATACAATAACCAAACAACCAA-3，扩增产物为154bp。25μl反应体系包括10×缓冲液，6.7mmol MgCl2，dNTP每管1.25mmol,引物150ng，硫化后DNA 25ng。95℃预变性5min后加Taq酶，PCR条件为：95℃ 30s,60℃ 30s,35个循环，72℃延伸4min。于20g/L琼脂糖凝胶上电泳，数码相机照相。
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6 p15基因的测定 用Trizol试剂盒提取细胞RNA后测吸光度(A)值或电泳鉴定其质量。RT反应液包括5×缓冲液，MLV 200U/μl，dNTP 2.5mmol,RNAsin 40U/μl,Oligodt 1μl,RNA 2μl,总体系为20μl。RT-PCR引物：p15引物1：5′-CCAGAAGCAATCCAGGCACG-3′;p15引物2：5′-CGTTGGCAGCCTTCATCG-3′，扩增产物为715bp。β-actin引物1 :5′-CCAAGGCCAACCGCCAGAAGATGA-3′；β-actin引物2：5′-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3′，扩增产物为583bp。25μl PCR体系含10×缓冲液，2.5mmol dNTP,150ng p15引物1，150ng p15引物2，200ng,Actin引物1,200ng Actin引物2,cDNA 3.0μl，2.0μl Taq酶。PCR条件：95℃预变性2min,95℃变性30s,60℃退火1min,72℃延伸1min,30个循环，72℃延伸7min。
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7 统计学处理 t检验。
结果
1 CdR对Molt 4 细胞生长的影响 CdR对Molt4细胞生长有明显的抑制作用，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)， Molt4细胞倍增时间显著延长(P<0.05)(图1)。
图1 CdR对Molt4细胞生长的影响
2 CdR对细胞周期的影响 不同浓度的CdR作用 Molt4细胞后G0/G1期细胞明显增加，与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.01)(表1)。
表1 不同浓度的CdR对Molt4细胞周期的影响(%，
±s) 组别, http://www.100md.com
G0/G1期细胞
G2/M期细胞
S期细胞
CdR 25μmol/L
51.07±1.15
4.03±0.47
43.23±1.22
CdR 50μmol/L
60.93±0.98
3.47±0.29
37.86±1.07
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20.6±0.64
13.15±0.70
61.09±1.81
3 Molt4细胞p15基因甲基化 Molt4细胞p15基因甲基化引物PCR阳性，未甲基化引物阴性，而U937细胞甲基化引物PCR阴性，而未甲基化引物阳性(图2)。
图2 Molt4细胞p15基因甲基化
4 CdR对细胞p15基因表达的影响 25μmol/L及50μmol/L CdR处理96h后，测定p15基因mRNA的表达，结果用药组表达强阳性，未用药组弱表达或不表达，半定量分析用药组与未用药组差异有显著性意义(P<0.01)，但两个剂量组之间差异不明显(图3)。
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图3 Molt4细胞 p15基因表达
讨论
CpG岛的甲基化常发生在肿瘤抑制基因启动子，灭活启动子功能，使肿瘤抑制基因不能够表达，导致白血病。我们用甲基化特异的PCR检测Molt 4细胞的甲基化，甲基化修饰只发生于5′～3′方向CG相联的C上，因此在亚硫酸氢钠作用后，DNA若无甲基化，则序列中的改变为C变为U，若有甲基化则C不会改变，用不同的引物进行PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛的甲基化。MSP对引物的设计有特殊要求，由于设计了甲基化引物M与非甲基化引物U，二者中至少有一个扩增 ，这样无需设定内参照。我们用MSP方法测定了Molt 4细胞p15基因甲基化，U937细胞作为对照，用p15基因甲基化的Molt4细胞作为去甲基化研究对象。
CdR的作用原理是抑制甲基转移酶活性，在分裂细胞DNA复制过程中，甲基不能够转移到胞嘧啶上，起去甲基化作用[2]。我们将p15基因甲基化的Molt 4细胞与CdR一起培养96h后用RT-PCR方法测定p15基因表达，结果p15基因重新表达，说明CdR使p15基因去甲基化。
, 百拇医药
流式细胞仪检测结果表明CdR处理的细胞G0/G1期细胞明显增加，说明CdR通过p15基因去甲基化，激活p15基因mRNA表达，恢复了对细胞周期负调节功能，抑制细胞增殖。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970318)
参考文献
1，Issa JPJ,Baylin SB,Herman JG.DNA methylation changes in hematologic malignancies:biologic and clinical implications.Leukemia,1997,11:s7-11.
2，Bender CM,Pao MM,Jones PA.Inhibition of DNA methylation by 5-aza-2-deoxycytidine suppresses the growth of human tumor cell lines.Cancer Res ,1998,58:95-101.
(收稿日期：1999-11-26), http://www.100md.com