用infiltrator导管向兔髂动脉壁内导入calponin基因的效果
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37c医学网
作者：苗志林 韩雅玲 王守力 刘莹 刘民培 王承利
单位：沈阳军区总医院心血管内科， 辽宁 沈阳 110015
关键词：Infiltrator导管；calponin；基因转染；基因治疗
第四军医大学学报001031 摘 要:目的 探讨calponin基因对血管再狭窄的防治作用;评价用infiltrator系统进行基因转染的实用价值. 方法 以pCAGGS质粒为基因载体,以脂质体为介导，用infiltrator浸壁球囊导管向兔髂动脉壁内导入人重组calponin基因. 结果 实验组(n=6)基因转染全部成功. 4 wk后转基因组血管内膜增生较轻，而对照组(n=6)血管内膜明显增生，管腔显著变窄. 未观察到与目的基因及转染系统相关的不良反应. 结论 infiltrator导管是活体局部转基因的合适工具；用该导管转染calponin基因可能成为防治血管再狭窄的有效方法.
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中图号：R543 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1268-03
Local intramural delivery of calponin to rabbit iliac arteries by infiltrator catheter
MIAO Zhi-Lin, HAN Ya-Ling, WANG Shou-Li,LIU Ying,LIU Min-Pei,WANG Cheng-Li
(Department of Cardiology, General Hospital of Shenyang Command of Chinese PLA, Shnyang 110015,China)
Abstract:AIM To investigate the preventive effects of calponin on restenosis of blood vessel and to assess the value of infiltrator system in gene transfection. METHODS The human recombinant calponin gene was transferred into the iliac artery walls of rabbits with infiltrator cathetor. pCAGGS and liposome were used as vector and mediator.RESULTS Intimal proliferation was significant in control group(n=6) but slight in transfection group(n=6) 4 weeks after transfection.No adverse effects associated with calponin gene or infiltrator system were observed.CONCLUSION The infiltrator catheter is a suitable device for local gene transfer in vivo;calponin transfection with infiltrator system appears to be an effective method in prevention and treatment of blood vessel restenosis.
, 百拇医药
Keywords:infiltrator catheter; calponin; gene transfection; gene therapy
0 引言
利用球囊导管向血管壁局部导入基因是近年发展起来的一种新技术，常用于血管再狭窄(restenosis)防治的研究. 以往的球囊导管只能将基因释放到局部血管腔内. 自1996年推出一种能够将基因直接注入到血管壁全层的药物导入系统——浸壁球囊导管(infiltrator)，将传统的血管腔内给药发展为壁内给药，明显提高了转染效率. 我们利用该导管向兔髂动脉导入人重组calponin基因(hCN)，观察基因导入后局部血管壁病理变化和基因表达情况，探讨infiltrator导管的临床实用价值.
1 材料和方法
1.1 材料 日本大耳白兔24只，雌雄不限. 体质量的2.5 kg. 麻醉后切开皮肤和皮下组织，暴露并穿刺右股动脉，置入5F动脉鞘. 用普通球囊导管将局部髂动脉内膜擦伤，然后分成2组. ①转染hCN组:12只，用infiltrator系统进行基因转染，其中6只于转染后3 d检测基因表达；另6只于转染后4 wk做病理检查. ②对照组：12只，仅导入空载体质粒pCAGGS和liposome液. 检测项目及时间同hCN组. 由计算机辅助测量新生内膜(N)与中膜(M)面积比率(AN/AM). Infiltrator浸壁球囊导管内腔直径0.357 mm，球囊直径2.0 mm或2.5 mm，长15 mm，美国IVT公司生产. 药物导入所需压力101.325～202.650 kPa，注射时间10 s左右，注射容量0.4 mL. 球囊表面配置了3排(相隔120°)纵行排列的金属微注射乳头(7×3个，直径0.102 mm，高0.254 mm). hCN基因由Takahashi博士赠送.
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1.2 方法 用去离子水将hCN/pCAGGS DNA调制成1 g*L-1的溶液. 取liposome溶液1 mL，加入hCN/pCAGGS DNA液20 μL,充分混匀，室温放置30 min. 通过球囊向每只家兔右髂动脉壁内注入hCN/pCAGGS+liposome混合液0.4 mL,相当于导入8 μg hCN DNA.
1.2.1 血管平滑肌细胞总RNA的抽提 采用Isogen法[1]. 动物解剖后取局部血管段50～80 mg， 剪碎，加Isogen试剂(含400 mL*L-1的酚，Nippon Gene) 2 mL，做成匀浆. 室温静置5 min. 加适量氯仿，剧烈振荡15 s. 14 000 r*min-1 4℃离心15 min. 取上清，加入适量异丙醇混匀. 14 500 r*min-1 4℃离心10 min，后用700 mL*L-1冷乙醇洗2次. 将沉淀真空干燥，用DEPC处理水溶解. 按RNA 667 mg*L-1 DEPC水的浓度分装，-20℃冻存待用.
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1.2.2 hCN mRNA表达的测定 采用RT-PCR法. 将标本(167 g*L-1 DEPC水)60℃加热10 min后立即置冰桶中2 min，然后移入特制的试管(内含逆转录酶、缓冲剂和反应底物；Pharmacia Biotech)内，加pd(N)61 μL,DEPC处理水2 μL,致终体积33 μL. 室温放置1 min，充分混匀，37℃震荡水浴1 h. 取上述反应产物8 μL，加入3′-端引物[5′-GCTTGGGCCCTGGCTGGGTCCAGCC-3′(1067～1091 nt)]和5′-端引物[5′-GAGTGTGCAGACGGAACTTCAGCC-3′(39～62 nt),东洋ink]各1.25 μL，PCR缓冲液5 μL，dNTP4 μL，Taq DNA多聚酶0.5 μL,去离子水30 μL. 在PCR仪上进行以下循环：变性94℃ 40 s,退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1 min 30 s，共循环35次. 取终产物适量在20 mL*L-1琼脂糖凝胶上电泳.
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2 结果
2.1 hCN在局部血管壁组织的表达 转染hCN组6只动物左髂动脉血管组织均无hCN mRNA表达，右髂动脉局部血管均有表达. 除第3只动物表达稍弱外，其余5只动物hCN mRNA表达均很强(Fig 1). 对照组6只动物左右髂动脉均无hCN mRNA表达.
图 1 基因导入后hCN mRNA经RT-PCR后的产物电泳结果
Fig 1 RT-PCR product of hCN mRNA after gene transfection
R1-R6:rabbit No.1-6; L:left iliac artery; R:right iliac artery.
图 2 对照组右髂动脉内膜增生情况
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Fig 2 Intimal proliferation of right iliac artery in control group A: ×100 B： ×400
图 3 基因转染组右髂动脉内膜增生情况
Fig 3 Intimal proliferation of right iliac artery in transfection group A: ×100 B： ×400
2.2 血管壁形态学改变 髂动脉损伤4 wk后对照组局部血管内膜明显增生，管腔狭窄，多呈偏心性. 新生内膜中平滑肌细胞排列较紊乱,内皮下可见泡沫细胞. 血管中层平滑肌增生不明显(Fig 2A，B). 转染hCN组内膜增生较轻，为局限性增生(Fig 3A，B). 对照组AN/AM比率为(0.82±1.04)，转染hCN组为(0.16±0.08)，两者差异非常显著(P<0.01).
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3 讨论
Infiltrator浸壁球囊导管是第1个适用于人体的基因导入系统，其性能指标及应用条件已基本符合临床要求. Reimers等[2]用该导管向24例冠心病患者的40处血管段内导入长效类固醇，结果无一例发生合并症，证实了该导管的安全性. Teiger等[3]用该导管向兔髂动脉壁内注入示踪剂，结果数分钟内示踪剂可散布到血管壁全层且无盲区. Teiger等还证实，infiltrator导管的转导效率在90%以上，而其他种类的转基因导管转染效率很少超过25%. 我们观察到，用pCAGGS质粒为载体，以liposome为介导，用infiltrator球囊导管向实验动物髂动脉壁内导入8 μg hCN DNA,目的基因可在血管平滑肌细胞内表达，6只动物全部转染成功.
Calponin是一种抗细胞增殖基因，主要在人和动物的平滑肌组织中表达，参与平滑肌细胞的分裂、增殖和迁移[4]. Takahashi等[5]发现，血管损伤后修复时伴随平滑肌细胞的过度增生calponin的表达也下调. 本实验病理结果显示，兔髂动脉内膜擦伤后向局部血管壁成功导入calponin基因可明显抑制平滑肌细胞增生，显著降低血管再狭窄程度. 本实验未观察到与目的基因及转导系统有关的不良反应. 以上结果提示，用infiltrator浸壁球囊导管向血管壁导入calponin基因具有良好的应用前景，可能成为临床防治血管再狭窄的有效方法.
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作者简介:苗志林(1961-),男(汉族),吉林省辽源市人. 硕士,副主任医师,科副主任. Tel.(024)23892351 Ext.51121
参考文献:
[1] Chomczynski P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA,DNA and proteins from cell and tissue samples[J].Biotechniques,1993;15(3):532-534.
[2] Reimers B,Akiyama T,Moussa I et al. Local intrawall delivery of long -acting steroids before coronary stent implantation[J]. Eur Heart J,1997;18(Suppl):620.
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[3] Teiger E,sitbon M,Dupouy P et al. Suitability of the infiltrator device for local gene delivery within the media of rabbit iliac arteries[J]. Eur Heart J,1997;18(Suppl):500.
[4] Negoro N,Fukui R,Tsuchikane E et al.Down expression of calponin in smooth muscle of coronary artery lesion identifies a group of lesion at high risk for restenosis after athetectomy[J]. Circulation,1994;90(4):1-142.
[5] Takahashi K,Fukui R,Kato O et al. Percutaneous transluminal transfer of the human calponin gene for suppression of intimal hyperplasia following arterial balloon injury:A model for successful gene therapy for restenosis[J]. Circulation,1993;88(4):651-657.
收稿日期:1999-12-06; 修回日期:2000-02-16, 百拇医药
单位：沈阳军区总医院心血管内科， 辽宁 沈阳 110015
关键词：Infiltrator导管；calponin；基因转染；基因治疗
第四军医大学学报001031 摘 要:目的 探讨calponin基因对血管再狭窄的防治作用;评价用infiltrator系统进行基因转染的实用价值. 方法 以pCAGGS质粒为基因载体,以脂质体为介导，用infiltrator浸壁球囊导管向兔髂动脉壁内导入人重组calponin基因. 结果 实验组(n=6)基因转染全部成功. 4 wk后转基因组血管内膜增生较轻，而对照组(n=6)血管内膜明显增生，管腔显著变窄. 未观察到与目的基因及转染系统相关的不良反应. 结论 infiltrator导管是活体局部转基因的合适工具；用该导管转染calponin基因可能成为防治血管再狭窄的有效方法.
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中图号：R543 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1268-03
Local intramural delivery of calponin to rabbit iliac arteries by infiltrator catheter
MIAO Zhi-Lin, HAN Ya-Ling, WANG Shou-Li,LIU Ying,LIU Min-Pei,WANG Cheng-Li
(Department of Cardiology, General Hospital of Shenyang Command of Chinese PLA, Shnyang 110015,China)
Abstract:AIM To investigate the preventive effects of calponin on restenosis of blood vessel and to assess the value of infiltrator system in gene transfection. METHODS The human recombinant calponin gene was transferred into the iliac artery walls of rabbits with infiltrator cathetor. pCAGGS and liposome were used as vector and mediator.RESULTS Intimal proliferation was significant in control group(n=6) but slight in transfection group(n=6) 4 weeks after transfection.No adverse effects associated with calponin gene or infiltrator system were observed.CONCLUSION The infiltrator catheter is a suitable device for local gene transfer in vivo;calponin transfection with infiltrator system appears to be an effective method in prevention and treatment of blood vessel restenosis.
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Keywords:infiltrator catheter; calponin; gene transfection; gene therapy
0 引言
利用球囊导管向血管壁局部导入基因是近年发展起来的一种新技术，常用于血管再狭窄(restenosis)防治的研究. 以往的球囊导管只能将基因释放到局部血管腔内. 自1996年推出一种能够将基因直接注入到血管壁全层的药物导入系统——浸壁球囊导管(infiltrator)，将传统的血管腔内给药发展为壁内给药，明显提高了转染效率. 我们利用该导管向兔髂动脉导入人重组calponin基因(hCN)，观察基因导入后局部血管壁病理变化和基因表达情况，探讨infiltrator导管的临床实用价值.
1 材料和方法
1.1 材料 日本大耳白兔24只，雌雄不限. 体质量的2.5 kg. 麻醉后切开皮肤和皮下组织，暴露并穿刺右股动脉，置入5F动脉鞘. 用普通球囊导管将局部髂动脉内膜擦伤，然后分成2组. ①转染hCN组:12只，用infiltrator系统进行基因转染，其中6只于转染后3 d检测基因表达；另6只于转染后4 wk做病理检查. ②对照组：12只，仅导入空载体质粒pCAGGS和liposome液. 检测项目及时间同hCN组. 由计算机辅助测量新生内膜(N)与中膜(M)面积比率(AN/AM). Infiltrator浸壁球囊导管内腔直径0.357 mm，球囊直径2.0 mm或2.5 mm，长15 mm，美国IVT公司生产. 药物导入所需压力101.325～202.650 kPa，注射时间10 s左右，注射容量0.4 mL. 球囊表面配置了3排(相隔120°)纵行排列的金属微注射乳头(7×3个，直径0.102 mm，高0.254 mm). hCN基因由Takahashi博士赠送.
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1.2 方法 用去离子水将hCN/pCAGGS DNA调制成1 g*L-1的溶液. 取liposome溶液1 mL，加入hCN/pCAGGS DNA液20 μL,充分混匀，室温放置30 min. 通过球囊向每只家兔右髂动脉壁内注入hCN/pCAGGS+liposome混合液0.4 mL,相当于导入8 μg hCN DNA.
1.2.1 血管平滑肌细胞总RNA的抽提 采用Isogen法[1]. 动物解剖后取局部血管段50～80 mg， 剪碎，加Isogen试剂(含400 mL*L-1的酚，Nippon Gene) 2 mL，做成匀浆. 室温静置5 min. 加适量氯仿，剧烈振荡15 s. 14 000 r*min-1 4℃离心15 min. 取上清，加入适量异丙醇混匀. 14 500 r*min-1 4℃离心10 min，后用700 mL*L-1冷乙醇洗2次. 将沉淀真空干燥，用DEPC处理水溶解. 按RNA 667 mg*L-1 DEPC水的浓度分装，-20℃冻存待用.
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1.2.2 hCN mRNA表达的测定 采用RT-PCR法. 将标本(167 g*L-1 DEPC水)60℃加热10 min后立即置冰桶中2 min，然后移入特制的试管(内含逆转录酶、缓冲剂和反应底物；Pharmacia Biotech)内，加pd(N)61 μL,DEPC处理水2 μL,致终体积33 μL. 室温放置1 min，充分混匀，37℃震荡水浴1 h. 取上述反应产物8 μL，加入3′-端引物[5′-GCTTGGGCCCTGGCTGGGTCCAGCC-3′(1067～1091 nt)]和5′-端引物[5′-GAGTGTGCAGACGGAACTTCAGCC-3′(39～62 nt),东洋ink]各1.25 μL，PCR缓冲液5 μL，dNTP4 μL，Taq DNA多聚酶0.5 μL,去离子水30 μL. 在PCR仪上进行以下循环：变性94℃ 40 s,退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1 min 30 s，共循环35次. 取终产物适量在20 mL*L-1琼脂糖凝胶上电泳.
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2 结果
2.1 hCN在局部血管壁组织的表达 转染hCN组6只动物左髂动脉血管组织均无hCN mRNA表达，右髂动脉局部血管均有表达. 除第3只动物表达稍弱外，其余5只动物hCN mRNA表达均很强(Fig 1). 对照组6只动物左右髂动脉均无hCN mRNA表达.
图 1 基因导入后hCN mRNA经RT-PCR后的产物电泳结果
Fig 1 RT-PCR product of hCN mRNA after gene transfection
R1-R6:rabbit No.1-6; L:left iliac artery; R:right iliac artery.
图 2 对照组右髂动脉内膜增生情况
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Fig 2 Intimal proliferation of right iliac artery in control group A: ×100 B： ×400
图 3 基因转染组右髂动脉内膜增生情况
Fig 3 Intimal proliferation of right iliac artery in transfection group A: ×100 B： ×400
2.2 血管壁形态学改变 髂动脉损伤4 wk后对照组局部血管内膜明显增生，管腔狭窄，多呈偏心性. 新生内膜中平滑肌细胞排列较紊乱,内皮下可见泡沫细胞. 血管中层平滑肌增生不明显(Fig 2A，B). 转染hCN组内膜增生较轻，为局限性增生(Fig 3A，B). 对照组AN/AM比率为(0.82±1.04)，转染hCN组为(0.16±0.08)，两者差异非常显著(P<0.01).
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3 讨论
Infiltrator浸壁球囊导管是第1个适用于人体的基因导入系统，其性能指标及应用条件已基本符合临床要求. Reimers等[2]用该导管向24例冠心病患者的40处血管段内导入长效类固醇，结果无一例发生合并症，证实了该导管的安全性. Teiger等[3]用该导管向兔髂动脉壁内注入示踪剂，结果数分钟内示踪剂可散布到血管壁全层且无盲区. Teiger等还证实，infiltrator导管的转导效率在90%以上，而其他种类的转基因导管转染效率很少超过25%. 我们观察到，用pCAGGS质粒为载体，以liposome为介导，用infiltrator球囊导管向实验动物髂动脉壁内导入8 μg hCN DNA,目的基因可在血管平滑肌细胞内表达，6只动物全部转染成功.
Calponin是一种抗细胞增殖基因，主要在人和动物的平滑肌组织中表达，参与平滑肌细胞的分裂、增殖和迁移[4]. Takahashi等[5]发现，血管损伤后修复时伴随平滑肌细胞的过度增生calponin的表达也下调. 本实验病理结果显示，兔髂动脉内膜擦伤后向局部血管壁成功导入calponin基因可明显抑制平滑肌细胞增生，显著降低血管再狭窄程度. 本实验未观察到与目的基因及转导系统有关的不良反应. 以上结果提示，用infiltrator浸壁球囊导管向血管壁导入calponin基因具有良好的应用前景，可能成为临床防治血管再狭窄的有效方法.
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作者简介:苗志林(1961-),男(汉族),吉林省辽源市人. 硕士,副主任医师,科副主任. Tel.(024)23892351 Ext.51121
参考文献:
[1] Chomczynski P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA,DNA and proteins from cell and tissue samples[J].Biotechniques,1993;15(3):532-534.
[2] Reimers B,Akiyama T,Moussa I et al. Local intrawall delivery of long -acting steroids before coronary stent implantation[J]. Eur Heart J,1997;18(Suppl):620.
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[3] Teiger E,sitbon M,Dupouy P et al. Suitability of the infiltrator device for local gene delivery within the media of rabbit iliac arteries[J]. Eur Heart J,1997;18(Suppl):500.
[4] Negoro N,Fukui R,Tsuchikane E et al.Down expression of calponin in smooth muscle of coronary artery lesion identifies a group of lesion at high risk for restenosis after athetectomy[J]. Circulation,1994;90(4):1-142.
[5] Takahashi K,Fukui R,Kato O et al. Percutaneous transluminal transfer of the human calponin gene for suppression of intimal hyperplasia following arterial balloon injury:A model for successful gene therapy for restenosis[J]. Circulation,1993;88(4):651-657.
收稿日期:1999-12-06; 修回日期:2000-02-16, 百拇医药