表没食子儿茶素没食子酸酯抗突变的实验研究
http://www.100md.com
37c医学网
作者：梁钢 符麟军
单位：广西医科大学药理学教研室，南宁 530021
关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯微核姐妹染色单体互换抗突变
广西预防医学000403
[摘要]目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗突变作用。方法以昆明纯种小鼠的骨髓细胞为实验材料，用公认的诱变剂环磷酰胺(CP)诱发的微核(MN)率和姐妹染色单体互换(SCE)频率为指标，研究EGCG对CP诱导小鼠骨髓细胞MN和SCE的影响。结果EGCG对MN和SCE均具明显抑制作用。结论EGCG具有抗突变和潜在的预防肿瘤的作用。
中图分类号：R979.1 文献标识码：A
文章编号：1007-158X(2000)04-0201-04
, http://www.100md.com
Inhibition of epigallocatechin gallate on micronucleus and sister chromatid exchanges induced by cyclophosphamide
LIANG Gang,FU Linjun.
(Department of Pharmacology,Guangxi Medical University,Nanning 530021)
[Astract]Objective To study antimutation of epigallocatechin gallate(EGCG) .Methods The bone marrow cells of pure Kumming species of mice were used as experimental material in which the micronucleus(MN)and sister chromatid exchanges(SCE) induced by cyclophosphamide(CP) were used as an index.Results EGCG showed the inhibition on MN and SCE induced by CP.Conclusion EGCG has antimutation and a potential prevention action of tumor.
, 百拇医药
[Key words]Epigallocatechin gallate Micronucleus Sister chromatid exchanges Antimutation.
随着医学科学的发展，人们对肿瘤的研究越来越深入，多数学者认为诱变剂→基因突变→癌变这一学说可解释大部分肿瘤的发生原因，因此灭活诱变原，防止基因突变乃是预防肿瘤的关键。从天然食物或药物中寻找具有抑制诱变原的天然有机物是较为经济而有效的防止肿瘤的手段。流行病学调查显示，饮用绿茶人群中某些肿瘤，例如胃肠肿瘤发生率较低。绿茶提取物(GTE)对多种致癌物诱导的啮齿动物肿瘤包括皮肤、肺、前胃、食管、结肠、十二指肠等肿瘤有抑制作用[1]。GTE主要由4种多酚类化合物组成，即表儿茶素(EC)，表儿茶素没食子酸酯(ECG)，表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，其中EGCG是主要的有效成分。有报道，EGCG对体外培养细胞的DNA损伤有抑制作用[2]，但在体内是否有抗突变防肿瘤作用则未见报道。本研究以小鼠骨髓细胞微核(MN)率和姐妹染色单体互换(SCE)为指标，对EGCG抗突变和防癌作用进行了探讨。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1药物表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechingallate,EGCG)，纯度>98%；茶多酚(GreenTeaPolyhenols,GTP)，由广西医科大学化学教研室提供。环磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)购自上海华联制药公司。秋水仙素为上海化工试剂厂生产。5-Brdu为Fluka公司产品。
1.1.2动物昆明纯种小鼠(20～22g),雌雄兼用，由广西医科大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1动物分组及处理随机分为6组：正常对照组、模型组、EGCG高剂量(40mg/kg)、中剂量(20mg/kg)、低剂量(10mg/kg)组和GTP(40mg/kg)组。每组5只。用药各剂量组每天灌胃1次，正常对照组和模型组用等容积蒸馏水灌胃1次，连续10天。MN指标各组于第10天灌胃后，腹腔注射CP(40mg/kg)，空白对照组注射等量生理盐水。第2天处死小鼠取骨髓细胞。SCE指标各组于取材前30小时，除正常组外，各组小鼠分别腹腔注射CP20mg/kg，取材前24小时各组小鼠腹腔注射活性碳吸附的5-Brdu1.5g/kg，取材前4小时腹腔注射秋水仙素5mg/kg。
, 百拇医药
1.2.2微核制片及统计颈椎脱臼处死小鼠，取股骨，剔去肌肉，用约1滴小牛血清冲洗骨髓细胞于载玻片上，常规涂片，Giemsa染色，油镜下双盲法计数每样本1000个嗜多染红细胞(PCE)出现的微核数，计算微核率(‰)，统计分析选用泊松检验[3]。
1.2.3SCE制片及统计按上法处死小鼠，取骨髓细胞置生理盐水中，离心(1000转/分)8分钟，去上清液，加37℃预温的0.4%KCl3ml，置37℃低渗30分钟，加入固定液(甲醇：冰醋酸为3：1)1ml混匀，连续固定2次，气干法滴片，片子置37℃老化1～2天，置60℃烤箱中1～2小时，用2×SSC(氯化钠枸椽酸钠液)浸润，30瓦紫外灯照射30分钟，Giemsa染色。于油镜下每组观察100个有差别染色的中期分裂相，统计出SCE总数及均数，统计分析选用方差检验[4]。
2 结果
2.1 对CP诱导小鼠骨髓细胞MN率的影响 结果如表1所示，实验对照组和空白对照组微核率有显著差异(P<0.01)，说明CP的致突变作用明显。EGCG各组及GTP组的微核率介于两个对照组之间，且小于实验对照组，除EGCG小剂量组P<0.05外，其余各组与实验对照组比均P<0.01，其中以EGCG大剂量组抑制最明显，抑制强度大于相同剂量的GTP组，EGCG各组呈一定的剂量依赖关系。提示EGCG具有良好的抗突变作用。
, 百拇医药
表1 EGCG对CP诱导小鼠骨髓细胞MN率的影响 组别
剂量
(mg/kg)
N
观察
细胞
MN数
MN率
(‰)
正常对照
等容积水
5
5000
, 百拇医药
12
2.4**
实验对照
等容积水
5
5000
90
18.0
EGCG
10
5
5000
61
, 百拇医药
12.2*
EGCG
20
5
5000
43
8.6**
EGCG
40
5
5000
32
6.4**
, 百拇医药
GTP
40
5
5000
42
8.4**
*与实验对照组比P<0.05，**与实验对照组比P<0.01
2.2 对CP诱导的小鼠骨髓细胞SCE的影响 结果见表2，各用药组小鼠与模型组小鼠均注入等量公认的诱变剂CP，模型组小鼠骨髓细胞中期分裂相的SCE频率因CP的致突变作用而明显增高，与不用CP的正常对照比较有显著差异(P<0.01)。EGCG各剂量组和GTP组可使中期分裂相SCE频率明显下降，与模型组有显著差异(P<0.01)，其中以EGCG大剂量组抑制最为明显，且高于GTP相同剂量组，EGCG各剂量间呈剂量依赖关系。提示EGCG对CP诱发的SCE有明显抑制作用，而且在GTP各儿茶素成分中，EGCG起主要作用。
, 百拇医药
表2 EGCG对CP诱导小鼠骨髓细胞SACE的影响 组别
剂量
(mg/kg)
N
SCE总数
SCE均数/中
期分裂相(
±s)
正常对照
等容积水
5
150
, 百拇医药
1.50±0.127*
实验对照
等容积水
5
893
8.93±0.288
EGCG
10
5
504
5.04±0.185*
EGCG
, 百拇医药
20
5
347
3.47±0.152*
EGCG
40
5
264
2.64±0.167*
GTP
40
5
379
, 百拇医药
3.79±0.185*
3 讨论
微核(micronucleus,MN)是真核细胞中的一种异常结构，是在细胞分裂的间期，游离于主核之外的园形或椭圆形结构。微核的多少和大小及姐妹染色单体交换的频率均可反映染色体突变的程度，这与DNA断裂受损和畸变是一致的。故其变化可用来评价各种理化因子致突变的能力，而其逆向思维则可检测抗变剂，国内外用此指标来研究中草药及其有效成分的体内抗突变作用尚不多。绿茶及其提取物具有防癌抗突变等多种生物功能[5,6,7]。EGCG是绿茶叶提取分离出的天然化合物，毒性很低，有很强的抗氧化作用。EGCG不仅有抗肿瘤作用，也可抑制某些致癌物的促癌作用[1,8]，对体外培养细胞的突变亦有抑制作用[2]。我们以CP诱导的小鼠骨髓细胞微核发生率和SCE频率为指标，进一步证实了EGCG有很强的体内抗突变作用,且两指标作用结果一致，其低剂量组经10天灌胃就可达有效的抗突变作用。抗变剂可能通过两种途径发挥抗突变作用,一是细胞外作用，药物直接灭活外源性诱变物，阻止细胞摄取诱变物和它在体内的活化；或者通过体内自由基的消除，减少自由基对DNA的损伤。二是细胞内作用，即药物阻止诱变物与靶分子发生作用，或者作用于DNA的修复过程。EGCG有很强的抗组织氧化作用，能消除体内自由基和提高体内自由基消除酶如超氧化物歧化酶(SOD)活性，尤其对最活泼也最具危害性的羟自由基(OH)有清除作用[9,10]，从而减少了体内自由基形成和由此所致的DNA损伤。此外，有报道EGCG还可抑制经甲基亚硝胺基吡啶(NNK)处理4～8周后的小鼠肺组织c-myc,c-raf,c-H-ras的基因表达[11],表明它可抑制致癌物诱导的癌基因表达，从细胞内阻止致变物对DNA损伤而激活癌基因。因此，其体内抗突变作用可能是一种整体效应，一方面提高机体对外源性诱变物的免疫力，另一方面抑制了诱变物质的诱变作用。体细胞突变的后果中最受注意的是致癌问题，基因受损或抑癌基因的变异以及癌基因的激活均与癌变有密切关系。EGCG的体内抗突变作用无疑为开发和利用其抗突变和防癌作用提供了有益的实验依据。
, 百拇医药
广西科技厅科学研究与技术开发课题(桂科攻9817091)
作者简介：梁钢(1957-)，男，广东省顺德市人，副教授，医学硕士，主要从事药理学研究工作。
参考文献
1，童彤.绿茶有效成分表没食子儿茶素没食子酸酯的肿瘤防治作用[J].国外医学(药学分册)，1998,25(4)：193
2，Jain A, Sethi N. Chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges in cultured human lymphocytes Ⅱ ,induced by epigallocatechin gal_late[J].Cytologia,1991,56(4):539
3，张均田主编.现代药理实验方法(下册)[M].北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:1886
, http://www.100md.com
4，王明艳，吴海涛，赵鸣芳,等.4种方药对环磷酸胺诱发的SCE的抑制作用[J].中成药，2000,22(3)：212
5，程书钧，何其傥，冯杰，等.绿茶多酚抑制突变和癌变的研究进展[J].癌变.畸变.突变，1989,1(1)：1
6，徐国平，宋圃菊.茶叶阻断胃癌高发区人体内源性亚硝基脯氨酸合成[J].北京医科大学学报，1991,23(2)：51
7，赵丽军，印泉，徐冠雄，等.酚类化合物抑制大鼠肝癌启动机理的研究[J].卫生毒理学杂志，1995,9(1)：1
8，梁钢，黄仁彬，黄志明，等.没食子酰表没食子儿茶素抗肿瘤作用的研究[J].广西医科大学学报，2000,17(2)：176
9，梁钢，黄志明，洪息君.儿茶素3种成分的抗氧化作用研究[J].广西医科大学学报，1998,15(1)：17
10，史霄燕.茶多酚的抗氧化作用及机制[J].国外医学(药学分册)，1998,25(4)：196
11，Hu G, Chen J.Inhibition of oncogene expres_sion by green tea and epigallocatechin gallate in mice[J].Nutr Cancer,1995,24( 2) :203
2000-04-19收稿, http://www.100md.com
单位：广西医科大学药理学教研室，南宁 530021
关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯微核姐妹染色单体互换抗突变
广西预防医学000403
[摘要]目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗突变作用。方法以昆明纯种小鼠的骨髓细胞为实验材料，用公认的诱变剂环磷酰胺(CP)诱发的微核(MN)率和姐妹染色单体互换(SCE)频率为指标，研究EGCG对CP诱导小鼠骨髓细胞MN和SCE的影响。结果EGCG对MN和SCE均具明显抑制作用。结论EGCG具有抗突变和潜在的预防肿瘤的作用。
中图分类号：R979.1 文献标识码：A
文章编号：1007-158X(2000)04-0201-04
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Inhibition of epigallocatechin gallate on micronucleus and sister chromatid exchanges induced by cyclophosphamide
LIANG Gang,FU Linjun.
(Department of Pharmacology,Guangxi Medical University,Nanning 530021)
[Astract]Objective To study antimutation of epigallocatechin gallate(EGCG) .Methods The bone marrow cells of pure Kumming species of mice were used as experimental material in which the micronucleus(MN)and sister chromatid exchanges(SCE) induced by cyclophosphamide(CP) were used as an index.Results EGCG showed the inhibition on MN and SCE induced by CP.Conclusion EGCG has antimutation and a potential prevention action of tumor.
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[Key words]Epigallocatechin gallate Micronucleus Sister chromatid exchanges Antimutation.
随着医学科学的发展，人们对肿瘤的研究越来越深入，多数学者认为诱变剂→基因突变→癌变这一学说可解释大部分肿瘤的发生原因，因此灭活诱变原，防止基因突变乃是预防肿瘤的关键。从天然食物或药物中寻找具有抑制诱变原的天然有机物是较为经济而有效的防止肿瘤的手段。流行病学调查显示，饮用绿茶人群中某些肿瘤，例如胃肠肿瘤发生率较低。绿茶提取物(GTE)对多种致癌物诱导的啮齿动物肿瘤包括皮肤、肺、前胃、食管、结肠、十二指肠等肿瘤有抑制作用[1]。GTE主要由4种多酚类化合物组成，即表儿茶素(EC)，表儿茶素没食子酸酯(ECG)，表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，其中EGCG是主要的有效成分。有报道，EGCG对体外培养细胞的DNA损伤有抑制作用[2]，但在体内是否有抗突变防肿瘤作用则未见报道。本研究以小鼠骨髓细胞微核(MN)率和姐妹染色单体互换(SCE)为指标，对EGCG抗突变和防癌作用进行了探讨。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1药物表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechingallate,EGCG)，纯度>98%；茶多酚(GreenTeaPolyhenols,GTP)，由广西医科大学化学教研室提供。环磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)购自上海华联制药公司。秋水仙素为上海化工试剂厂生产。5-Brdu为Fluka公司产品。
1.1.2动物昆明纯种小鼠(20～22g),雌雄兼用，由广西医科大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1动物分组及处理随机分为6组：正常对照组、模型组、EGCG高剂量(40mg/kg)、中剂量(20mg/kg)、低剂量(10mg/kg)组和GTP(40mg/kg)组。每组5只。用药各剂量组每天灌胃1次，正常对照组和模型组用等容积蒸馏水灌胃1次，连续10天。MN指标各组于第10天灌胃后，腹腔注射CP(40mg/kg)，空白对照组注射等量生理盐水。第2天处死小鼠取骨髓细胞。SCE指标各组于取材前30小时，除正常组外，各组小鼠分别腹腔注射CP20mg/kg，取材前24小时各组小鼠腹腔注射活性碳吸附的5-Brdu1.5g/kg，取材前4小时腹腔注射秋水仙素5mg/kg。
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1.2.2微核制片及统计颈椎脱臼处死小鼠，取股骨，剔去肌肉，用约1滴小牛血清冲洗骨髓细胞于载玻片上，常规涂片，Giemsa染色，油镜下双盲法计数每样本1000个嗜多染红细胞(PCE)出现的微核数，计算微核率(‰)，统计分析选用泊松检验[3]。
1.2.3SCE制片及统计按上法处死小鼠，取骨髓细胞置生理盐水中，离心(1000转/分)8分钟，去上清液，加37℃预温的0.4%KCl3ml，置37℃低渗30分钟，加入固定液(甲醇：冰醋酸为3：1)1ml混匀，连续固定2次，气干法滴片，片子置37℃老化1～2天，置60℃烤箱中1～2小时，用2×SSC(氯化钠枸椽酸钠液)浸润，30瓦紫外灯照射30分钟，Giemsa染色。于油镜下每组观察100个有差别染色的中期分裂相，统计出SCE总数及均数，统计分析选用方差检验[4]。
2 结果
2.1 对CP诱导小鼠骨髓细胞MN率的影响 结果如表1所示，实验对照组和空白对照组微核率有显著差异(P<0.01)，说明CP的致突变作用明显。EGCG各组及GTP组的微核率介于两个对照组之间，且小于实验对照组，除EGCG小剂量组P<0.05外，其余各组与实验对照组比均P<0.01，其中以EGCG大剂量组抑制最明显，抑制强度大于相同剂量的GTP组，EGCG各组呈一定的剂量依赖关系。提示EGCG具有良好的抗突变作用。
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表1 EGCG对CP诱导小鼠骨髓细胞MN率的影响 组别
剂量
(mg/kg)
N
观察
细胞
MN数
MN率
(‰)
正常对照
等容积水
5
5000
, 百拇医药
12
2.4**
实验对照
等容积水
5
5000
90
18.0
EGCG
10
5
5000
61
, 百拇医药
12.2*
EGCG
20
5
5000
43
8.6**
EGCG
40
5
5000
32
6.4**
, 百拇医药
GTP
40
5
5000
42
8.4**
*与实验对照组比P<0.05，**与实验对照组比P<0.01
2.2 对CP诱导的小鼠骨髓细胞SCE的影响 结果见表2，各用药组小鼠与模型组小鼠均注入等量公认的诱变剂CP，模型组小鼠骨髓细胞中期分裂相的SCE频率因CP的致突变作用而明显增高，与不用CP的正常对照比较有显著差异(P<0.01)。EGCG各剂量组和GTP组可使中期分裂相SCE频率明显下降，与模型组有显著差异(P<0.01)，其中以EGCG大剂量组抑制最为明显，且高于GTP相同剂量组，EGCG各剂量间呈剂量依赖关系。提示EGCG对CP诱发的SCE有明显抑制作用，而且在GTP各儿茶素成分中，EGCG起主要作用。
, 百拇医药
表2 EGCG对CP诱导小鼠骨髓细胞SACE的影响 组别
剂量
(mg/kg)
N
SCE总数
SCE均数/中
期分裂相(
±s)正常对照
等容积水
5
150
, 百拇医药
1.50±0.127*
实验对照
等容积水
5
893
8.93±0.288
EGCG
10
5
504
5.04±0.185*
EGCG
, 百拇医药
20
5
347
3.47±0.152*
EGCG
40
5
264
2.64±0.167*
GTP
40
5
379
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3.79±0.185*
3 讨论
微核(micronucleus,MN)是真核细胞中的一种异常结构，是在细胞分裂的间期，游离于主核之外的园形或椭圆形结构。微核的多少和大小及姐妹染色单体交换的频率均可反映染色体突变的程度，这与DNA断裂受损和畸变是一致的。故其变化可用来评价各种理化因子致突变的能力，而其逆向思维则可检测抗变剂，国内外用此指标来研究中草药及其有效成分的体内抗突变作用尚不多。绿茶及其提取物具有防癌抗突变等多种生物功能[5,6,7]。EGCG是绿茶叶提取分离出的天然化合物，毒性很低，有很强的抗氧化作用。EGCG不仅有抗肿瘤作用，也可抑制某些致癌物的促癌作用[1,8]，对体外培养细胞的突变亦有抑制作用[2]。我们以CP诱导的小鼠骨髓细胞微核发生率和SCE频率为指标，进一步证实了EGCG有很强的体内抗突变作用,且两指标作用结果一致，其低剂量组经10天灌胃就可达有效的抗突变作用。抗变剂可能通过两种途径发挥抗突变作用,一是细胞外作用，药物直接灭活外源性诱变物，阻止细胞摄取诱变物和它在体内的活化；或者通过体内自由基的消除，减少自由基对DNA的损伤。二是细胞内作用，即药物阻止诱变物与靶分子发生作用，或者作用于DNA的修复过程。EGCG有很强的抗组织氧化作用，能消除体内自由基和提高体内自由基消除酶如超氧化物歧化酶(SOD)活性，尤其对最活泼也最具危害性的羟自由基(OH)有清除作用[9,10]，从而减少了体内自由基形成和由此所致的DNA损伤。此外，有报道EGCG还可抑制经甲基亚硝胺基吡啶(NNK)处理4～8周后的小鼠肺组织c-myc,c-raf,c-H-ras的基因表达[11],表明它可抑制致癌物诱导的癌基因表达，从细胞内阻止致变物对DNA损伤而激活癌基因。因此，其体内抗突变作用可能是一种整体效应，一方面提高机体对外源性诱变物的免疫力，另一方面抑制了诱变物质的诱变作用。体细胞突变的后果中最受注意的是致癌问题，基因受损或抑癌基因的变异以及癌基因的激活均与癌变有密切关系。EGCG的体内抗突变作用无疑为开发和利用其抗突变和防癌作用提供了有益的实验依据。
, 百拇医药
广西科技厅科学研究与技术开发课题(桂科攻9817091)
作者简介：梁钢(1957-)，男，广东省顺德市人，副教授，医学硕士，主要从事药理学研究工作。
参考文献
1，童彤.绿茶有效成分表没食子儿茶素没食子酸酯的肿瘤防治作用[J].国外医学(药学分册)，1998,25(4)：193
2，Jain A, Sethi N. Chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges in cultured human lymphocytes Ⅱ ,induced by epigallocatechin gal_late[J].Cytologia,1991,56(4):539
3，张均田主编.现代药理实验方法(下册)[M].北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:1886
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4，王明艳，吴海涛，赵鸣芳,等.4种方药对环磷酸胺诱发的SCE的抑制作用[J].中成药，2000,22(3)：212
5，程书钧，何其傥，冯杰，等.绿茶多酚抑制突变和癌变的研究进展[J].癌变.畸变.突变，1989,1(1)：1
6，徐国平，宋圃菊.茶叶阻断胃癌高发区人体内源性亚硝基脯氨酸合成[J].北京医科大学学报，1991,23(2)：51
7，赵丽军，印泉，徐冠雄，等.酚类化合物抑制大鼠肝癌启动机理的研究[J].卫生毒理学杂志，1995,9(1)：1
8，梁钢，黄仁彬，黄志明，等.没食子酰表没食子儿茶素抗肿瘤作用的研究[J].广西医科大学学报，2000,17(2)：176
9，梁钢，黄志明，洪息君.儿茶素3种成分的抗氧化作用研究[J].广西医科大学学报，1998,15(1)：17
10，史霄燕.茶多酚的抗氧化作用及机制[J].国外医学(药学分册)，1998,25(4)：196
11，Hu G, Chen J.Inhibition of oncogene expres_sion by green tea and epigallocatechin gallate in mice[J].Nutr Cancer,1995,24( 2) :203
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