几种茶叶多糖对佐剂性关节炎大鼠免疫指标的影响
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作者：张运芳 金涌 李俊 汪东风 徐叔云
单位：张运芳 金涌 李俊 徐叔云(安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032)；汪东风(安徽农业大学茶叶系，合肥 230034)
关键词：关节炎；佐剂性；茶叶；化学；多糖类；药理学
安徽医科大学学报000109 摘要 目的 研究几种不同提取途径的茶叶多糖(TPS)对佐剂性关节炎(AA)大鼠免疫指标的影响。方法 采用AA大鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞体外培养技术研究几种TPS对其功能的影响。结果 几种茶叶多糖提高AA大鼠过低的脾淋巴细胞增殖反应和IL-2趋势，其中P2途径提取的TPS对脾淋巴细胞增殖反应和IL-2具有明显的促进作用(P<0.05)；对AA大鼠腹腔巨噬细胞产生过高的IL-1，几种不同途径提取的TPS均有降低趋势，以P2茶叶多糖的作用最显著(P<0.05)。结论 P2TPS对AA大鼠免疫指标具有明显的调节作用。
, 百拇医药
中图分类号 R282.71；R684.3；R332
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0027-03
Effects of TPS on immune index of rats with adjuvant arthritis
Zhang Yunfang, Jin Yong, Li Jun et al
(Institute of Pharmacology,Anhui Medical University,Hefei 230032)
Abstract Objective To study the effect of TPS (Tea poly-saccharides) extracted by different methods on immune function of rats with AA. Methods Using cultured spleen lymphocyte and peritoneal macrophage (PMΦ) in vitro for studing the effect of TPS on its action. Results All of the TPS trended to increase the lower level of speen lymphocyte proliferative reaction and IL-2 in rats with AA. P2 of the TPS could enhance markedly (P<0.05). All of the TPS could decrease the higher level of IL-1 produced by PMΦ in rats with AA and P2 of the TPS could also decrease markedly (P<0.05). Conculsion P2 may have markedly immunoregulatory effects on immune index of rats with AA.
, 百拇医药
MeSH arthritis, adjuvant; folium camelliae/chemistry; polysaccharides/pharmacology
茶叶为山茶科植物，其药用价值历史悠久。随着对茶叶成分、药理作用的深入研究，发现茶叶的医疗作用范围广泛。茶叶能提高人体免疫机能，这作用可能与茶叶多糖免疫调节有关〔1～3〕。为了解茶叶多糖(Tea Polysaccharides, TPS)的免疫调节作用。本文观察了不同提取途径的TPS对佐剂性关节炎大鼠免疫指标的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，体重200 g±20 g本校实验动物中心提供(皖医动准字002)；ConA、LPS，美国Sigma公司产品；P1、P2、P3、P4、P5水提醇沉，采用不同方法精制的多糖，分子量约7000，由安徽农业大学茶叶系提供；FJ-2107型液体闪烁仪，西安262厂生产。
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1.2 方法
1.2.1 CFA的制备 参照文献〔1〕将同一批号的BCG80℃ 1 h灭活，以高压灭菌的液体石蜡配成10 g.L-1的乳剂，置4℃冰箱备用。
1.2.2 大鼠AA的制备 选取大鼠，体重180 g±20 g，于每鼠左足跖皮内注射0.1 ml致炎。
1.2.3 ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞增殖反应〔4〕 用RPMI-1640培养液常规制备大鼠细胞悬液(1010.L-1)，在96孔培养板上，每孔加入100 μl脾淋巴细胞悬液(终浓度5×109.L-1)、50 μl 5种TPS(P1、P2、P3、P4、P5)(终浓度100 μmol.L-1)、50 μl ConA(3 mg.L-1)，终容积为200 μl，各设3个复孔，置37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，终止培养前6 h，每孔加入20 μl3H-TdR(7.4×103 Bq.孔-1)，用多头细胞收集器收集细胞于69型纤维滤纸上，用液闪仪测定cpm值，以3个复孔的均值表示结果。
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1.2.4 IL-2的产生与检测〔5〕 以RPMI-1640培养液常规制备大鼠脾细胞悬液(1010.L-1)，在24孔培养板上，每孔加入0.5 ml上述脾细胞悬液(终浓度为5×109.L-1)，0.25 ml ConA(终浓度为3 mg.L-1)和0.25 ml几种不同的TPS(终浓度100 μmol.L-1)置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，离心(2000 r.min-1，10 min)收集上清，即为IL-2活性的上清液，-20℃保存待测。参照文献〔4〕制备ConA活化的小鼠脾细胞，用以测定IL-2活性。在96孔培养板上，每孔加入不同稀释度的IL-2待测上清，每一稀释度设3个复孔，然后加入100 μl活化的小鼠脾细胞悬液。置37℃，5% CO2培养箱培养24 h，终止培养前6 h加入20 μl3H-TdR，培养结束后，用多头细胞收集器收集细胞69型纤维滤纸上，用液闪仪测定放射性，结果以3个复孔的cpm均值表示。
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1.2.5 IL-1的产生与检测〔6〕 以RPMI-1640培养液常规制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液(2×109.L-1)，加入24孔培养板，每孔1 ml，置37℃，5% CO2培养箱中培育2 h，弃去培养液，并以5% NBS-Duleccos洗3遍，除去非粘附细胞，获单层MΦ，然后每孔加入LPS 0.5 ml(终浓度6 mg.L-1)和0.5 ml几种不同TPS(终浓度100 μmol.L-1)，置37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，收集上清即含IL-1活性的上清液，-20℃保存待测。参照文献〔5〕，用小鼠胸腺细胞增殖法检测IL-1，用正常C57 BL/6J小鼠，无菌取胸腺制成不同浓度。于96孔培养板上，每孔加入不同稀释度的上清100 μl，每一稀释度设3个复孔，加入50 μl胸腺细胞悬液和50 μl ConA(终浓度为3 mg.L-1)，置37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，终止培养前6 h，每孔加入20 μl 3H-TdR，培养结束后收集细胞用液闪仪测定放射性，以3个复孔的cpm均值表示结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 TPS对ConA诱导的AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响 表1所示，AA大鼠脾细胞增殖反应明显降低，而体外给予几种TPS(100 mg.L-1)对AA大鼠过低的脾淋巴细胞增殖反应均有不同程度的恢复作用，其中P2TPS能显著提高AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应(P<0.05)。
表1 TPS对ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞
增殖反应的影响(
±s, n=8) 组别ConA
剂量
(μmol.L-1)
, 百拇医药
诱导的增殖反应
(cpm×10-4)
正常
-
2.06±0.41##
AA
-
0.91±0.32
AA+P1
100
1.08±0.41
AA+P2
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100
1.35±0.39#
AA+P3
100
1.15±0.43
AA+P4
100
1.01±0.38
AA+P5
100
0.95±0.34
, 百拇医药
AA+地塞米松
100
0.80±0.21
与AA组比较，#P<0.05，##P<0.01
2.2 TPS对AA大鼠IL-2的影响 表2所示，AA大鼠脾细胞产生的IL-2明显降低，而几种TPS(100 mg.L-1)对AA大鼠脾淋巴细胞产生过低的IL-2均有恢复趋势，其中P2TPS能显著提高AA大鼠过低的IL-2水平(P<0.05)。
表2 TPS对AA大鼠IL-2产生的影响(±s, n=8) 组别
, 百拇医药
剂量(μl.L-1)
IL-2含量
(cpm×10-3)
正常
-
7.0±1.2
AA
-
3.5±1.0##
AA+P1
100
, 百拇医药
4.0±1.4
AA+P2
100
4.9±1.4.
AA+P3
100
3.9±1.2
AA+P4
100
3.6±1.0
AA+P5
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100
3.7±1.1
AA+地塞米松
100
3.1±1.3
与AA组比较，.P<0.05;与正常组比较，##P<0.01
2.3 TPS对AA大鼠IL-1产生的影响 表3所示，AA大鼠腹腔巨噬细胞产生的IL-1明显增高，而几种TPS(100 mg.L-1)对AA大鼠腹腔巨噬细胞产生过高的IL-1有抑制趋势，其中P2TPS能明显降低AA大鼠过高的IL-1的水平。
表3 TPS对大鼠IL-1产生的影响(±s, n=8) 组别
, http://www.100md.com
剂量(μmol.L-1)
IL-1含量
(cpm×10-3)
正常
-
5.1±1.9
AA
-
12.1±3.1##
AA+P1
100
, http://www.100md.com
9.9±2.2
AA+P2
100
9.1±2.1.
AA+P3
100
9.6±2.1
AA+P4
100
10.7±3.0
AA+P5
, http://www.100md.com
100
11.5±3.1
AA+地塞米松
100
7.2±2.0..
与正常组比较，##P<0.01；与AA组比较，.P<0.05，..P<0.013 讨论
茶叶具有广泛的药理作用，不仅具有抗癌、抗氧化、免疫调节等作用〔2〕。而且中国茶叶约含250多种成分，其中茶叶多糖(TPS)具有提高巨噬细胞和网状内皮细胞的吞噬功能〔3〕。我们的研究结果表明，几种不同途径提取的TPS均有提高AA大鼠过低的ConA和IL-2产生的趋势以及降低AA大鼠过高的IL-1产生的趋势，其中P2TPS作用最为显著。提示TPS可能具有双向免疫调节作用。因此，P2法提取的TPS有望成为新型的免疫调节药物。
, http://www.100md.com
作者简介：张运芳，女，35岁，实验师;
李 俊，男，39岁，博士，教授，博士生导师
参考文献
1，於传斌.免疫炎症模型.见徐叔云，卞如濂，陈，修主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991：723
2，于新蕊，曲，军，丛月珠.茶叶的化学成分及药理作用研究进展. 中草药，1999；26(6)：219～221
3，包翠屏.茶叶的药理研究概况.中医药信息.1992；(5)：23～24
4，Yamamcto I, Chmori H, Seasano M. ConA-induced proliferative response of splerocytes from arthritis rat. Drugs Exptl Clin Res, 1982;8(1):5
5，丁桂风，席宏丽，邓玉兰等.用活化小鼠脾细胞测定IL-2.上海免疫学杂志，1988；8(1)：64
6，梁君山，魏伟，周爱武等.白细胞介素-1的检测及白芍总甙对其产生的影响.中国药理学通报，1989；5(4)：354
1999-08-12收稿，1999-11-10修回, http://www.100md.com
单位：张运芳 金涌 李俊 徐叔云(安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032)；汪东风(安徽农业大学茶叶系，合肥 230034)
关键词：关节炎；佐剂性；茶叶；化学；多糖类；药理学
安徽医科大学学报000109 摘要 目的 研究几种不同提取途径的茶叶多糖(TPS)对佐剂性关节炎(AA)大鼠免疫指标的影响。方法 采用AA大鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞体外培养技术研究几种TPS对其功能的影响。结果 几种茶叶多糖提高AA大鼠过低的脾淋巴细胞增殖反应和IL-2趋势，其中P2途径提取的TPS对脾淋巴细胞增殖反应和IL-2具有明显的促进作用(P<0.05)；对AA大鼠腹腔巨噬细胞产生过高的IL-1，几种不同途径提取的TPS均有降低趋势，以P2茶叶多糖的作用最显著(P<0.05)。结论 P2TPS对AA大鼠免疫指标具有明显的调节作用。
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中图分类号 R282.71；R684.3；R332
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0027-03
Effects of TPS on immune index of rats with adjuvant arthritis
Zhang Yunfang, Jin Yong, Li Jun et al
(Institute of Pharmacology,Anhui Medical University,Hefei 230032)
Abstract Objective To study the effect of TPS (Tea poly-saccharides) extracted by different methods on immune function of rats with AA. Methods Using cultured spleen lymphocyte and peritoneal macrophage (PMΦ) in vitro for studing the effect of TPS on its action. Results All of the TPS trended to increase the lower level of speen lymphocyte proliferative reaction and IL-2 in rats with AA. P2 of the TPS could enhance markedly (P<0.05). All of the TPS could decrease the higher level of IL-1 produced by PMΦ in rats with AA and P2 of the TPS could also decrease markedly (P<0.05). Conculsion P2 may have markedly immunoregulatory effects on immune index of rats with AA.
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MeSH arthritis, adjuvant; folium camelliae/chemistry; polysaccharides/pharmacology
茶叶为山茶科植物，其药用价值历史悠久。随着对茶叶成分、药理作用的深入研究，发现茶叶的医疗作用范围广泛。茶叶能提高人体免疫机能，这作用可能与茶叶多糖免疫调节有关〔1～3〕。为了解茶叶多糖(Tea Polysaccharides, TPS)的免疫调节作用。本文观察了不同提取途径的TPS对佐剂性关节炎大鼠免疫指标的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，体重200 g±20 g本校实验动物中心提供(皖医动准字002)；ConA、LPS，美国Sigma公司产品；P1、P2、P3、P4、P5水提醇沉，采用不同方法精制的多糖，分子量约7000，由安徽农业大学茶叶系提供；FJ-2107型液体闪烁仪，西安262厂生产。
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1.2 方法
1.2.1 CFA的制备 参照文献〔1〕将同一批号的BCG80℃ 1 h灭活，以高压灭菌的液体石蜡配成10 g.L-1的乳剂，置4℃冰箱备用。
1.2.2 大鼠AA的制备 选取大鼠，体重180 g±20 g，于每鼠左足跖皮内注射0.1 ml致炎。
1.2.3 ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞增殖反应〔4〕 用RPMI-1640培养液常规制备大鼠细胞悬液(1010.L-1)，在96孔培养板上，每孔加入100 μl脾淋巴细胞悬液(终浓度5×109.L-1)、50 μl 5种TPS(P1、P2、P3、P4、P5)(终浓度100 μmol.L-1)、50 μl ConA(3 mg.L-1)，终容积为200 μl，各设3个复孔，置37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，终止培养前6 h，每孔加入20 μl3H-TdR(7.4×103 Bq.孔-1)，用多头细胞收集器收集细胞于69型纤维滤纸上，用液闪仪测定cpm值，以3个复孔的均值表示结果。
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1.2.4 IL-2的产生与检测〔5〕 以RPMI-1640培养液常规制备大鼠脾细胞悬液(1010.L-1)，在24孔培养板上，每孔加入0.5 ml上述脾细胞悬液(终浓度为5×109.L-1)，0.25 ml ConA(终浓度为3 mg.L-1)和0.25 ml几种不同的TPS(终浓度100 μmol.L-1)置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，离心(2000 r.min-1，10 min)收集上清，即为IL-2活性的上清液，-20℃保存待测。参照文献〔4〕制备ConA活化的小鼠脾细胞，用以测定IL-2活性。在96孔培养板上，每孔加入不同稀释度的IL-2待测上清，每一稀释度设3个复孔，然后加入100 μl活化的小鼠脾细胞悬液。置37℃，5% CO2培养箱培养24 h，终止培养前6 h加入20 μl3H-TdR，培养结束后，用多头细胞收集器收集细胞69型纤维滤纸上，用液闪仪测定放射性，结果以3个复孔的cpm均值表示。
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1.2.5 IL-1的产生与检测〔6〕 以RPMI-1640培养液常规制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液(2×109.L-1)，加入24孔培养板，每孔1 ml，置37℃，5% CO2培养箱中培育2 h，弃去培养液，并以5% NBS-Duleccos洗3遍，除去非粘附细胞，获单层MΦ，然后每孔加入LPS 0.5 ml(终浓度6 mg.L-1)和0.5 ml几种不同TPS(终浓度100 μmol.L-1)，置37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，收集上清即含IL-1活性的上清液，-20℃保存待测。参照文献〔5〕，用小鼠胸腺细胞增殖法检测IL-1，用正常C57 BL/6J小鼠，无菌取胸腺制成不同浓度。于96孔培养板上，每孔加入不同稀释度的上清100 μl，每一稀释度设3个复孔，加入50 μl胸腺细胞悬液和50 μl ConA(终浓度为3 mg.L-1)，置37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，终止培养前6 h，每孔加入20 μl 3H-TdR，培养结束后收集细胞用液闪仪测定放射性，以3个复孔的cpm均值表示结果。
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2 结果
2.1 TPS对ConA诱导的AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响 表1所示，AA大鼠脾细胞增殖反应明显降低，而体外给予几种TPS(100 mg.L-1)对AA大鼠过低的脾淋巴细胞增殖反应均有不同程度的恢复作用，其中P2TPS能显著提高AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应(P<0.05)。
表1 TPS对ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞
增殖反应的影响(
±s, n=8) 组别ConA剂量
(μmol.L-1)
, 百拇医药
诱导的增殖反应
(cpm×10-4)
正常
-
2.06±0.41##
AA
-
0.91±0.32
AA+P1
100
1.08±0.41
AA+P2
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1.35±0.39#
AA+P3
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1.15±0.43
AA+P4
100
1.01±0.38
AA+P5
100
0.95±0.34
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AA+地塞米松
100
0.80±0.21
与AA组比较，#P<0.05，##P<0.01
2.2 TPS对AA大鼠IL-2的影响 表2所示，AA大鼠脾细胞产生的IL-2明显降低，而几种TPS(100 mg.L-1)对AA大鼠脾淋巴细胞产生过低的IL-2均有恢复趋势，其中P2TPS能显著提高AA大鼠过低的IL-2水平(P<0.05)。
表2 TPS对AA大鼠IL-2产生的影响(
±s, n=8) 组别, 百拇医药
剂量(μl.L-1)
IL-2含量
(cpm×10-3)
正常
-
7.0±1.2
AA
-
3.5±1.0##
AA+P1
100
, 百拇医药
4.0±1.4
AA+P2
100
4.9±1.4.
AA+P3
100
3.9±1.2
AA+P4
100
3.6±1.0
AA+P5
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3.7±1.1
AA+地塞米松
100
3.1±1.3
与AA组比较，.P<0.05;与正常组比较，##P<0.01
2.3 TPS对AA大鼠IL-1产生的影响 表3所示，AA大鼠腹腔巨噬细胞产生的IL-1明显增高，而几种TPS(100 mg.L-1)对AA大鼠腹腔巨噬细胞产生过高的IL-1有抑制趋势，其中P2TPS能明显降低AA大鼠过高的IL-1的水平。
表3 TPS对大鼠IL-1产生的影响(
±s, n=8) 组别, http://www.100md.com
剂量(μmol.L-1)
IL-1含量
(cpm×10-3)
正常
-
5.1±1.9
AA
-
12.1±3.1##
AA+P1
100
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9.9±2.2
AA+P2
100
9.1±2.1.
AA+P3
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9.6±2.1
AA+P4
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10.7±3.0
AA+P5
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11.5±3.1
AA+地塞米松
100
7.2±2.0..
与正常组比较，##P<0.01；与AA组比较，.P<0.05，..P<0.013 讨论
茶叶具有广泛的药理作用，不仅具有抗癌、抗氧化、免疫调节等作用〔2〕。而且中国茶叶约含250多种成分，其中茶叶多糖(TPS)具有提高巨噬细胞和网状内皮细胞的吞噬功能〔3〕。我们的研究结果表明，几种不同途径提取的TPS均有提高AA大鼠过低的ConA和IL-2产生的趋势以及降低AA大鼠过高的IL-1产生的趋势，其中P2TPS作用最为显著。提示TPS可能具有双向免疫调节作用。因此，P2法提取的TPS有望成为新型的免疫调节药物。
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作者简介：张运芳，女，35岁，实验师;
李 俊，男，39岁，博士，教授，博士生导师
参考文献
1，於传斌.免疫炎症模型.见徐叔云，卞如濂，陈，修主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991：723
2，于新蕊，曲，军，丛月珠.茶叶的化学成分及药理作用研究进展. 中草药，1999；26(6)：219～221
3，包翠屏.茶叶的药理研究概况.中医药信息.1992；(5)：23～24
4，Yamamcto I, Chmori H, Seasano M. ConA-induced proliferative response of splerocytes from arthritis rat. Drugs Exptl Clin Res, 1982;8(1):5
5，丁桂风，席宏丽，邓玉兰等.用活化小鼠脾细胞测定IL-2.上海免疫学杂志，1988；8(1)：64
6，梁君山，魏伟，周爱武等.白细胞介素-1的检测及白芍总甙对其产生的影响.中国药理学通报，1989；5(4)：354
1999-08-12收稿，1999-11-10修回, http://www.100md.com