结构基质蛋白在脑血管畸形的表达
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37c医学网
作者：袁葛 赵继宗
单位：(首都医科大学附属北京天坛医院神经外科)
关键词：结构基质蛋白；脑动静脉畸形；海绵状血管瘤
首都医科大学学报000117 摘 要：对2种不同类型的脑血管畸形脑动静脉畸形(AVMs)及海绵状血管瘤(CMs)的标本、正常脑组织血管标本、血管网状细胞瘤标本进行免疫组化染色，观察4种血管结构基质蛋白(LM、FN、Ⅳc、αSMA)的表达。结果：LM和FN在AVMs与CMs中的表达不同，均存在显著性差异(P<0.01)；而Ⅳc及αSMA在所有血管中均有表达。结果提示：AVMs血管发育较为成熟，而CMs具有未成熟血管特征。
分类号：R651.1
Expression of Matrix and Structural Proteins
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in Cerebral Vascular Malformations
Yuan Ge Zhao Jizong
(Department of Neurosurgery, Beijing Tiantan Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract：Specimens of 22 cases of arteriovenous malformations (AVMs) and 22 cases of cavernous malformations (CMs) were paraffin-processed with immunohistochemical staining. Four types of matrix and structural proteins (LM, FN, Ⅳc, αSMA) were examined. The results were analyzed by two observes blinded to the antibody and lesion type, and were evaluated in three classes. The AVMs exhibited positive for LM in 9/22, while none of the CMs demonstrated LM expression (P<0.01). By contrast, FN expression was more prominent in CMs than that in AVMs (P<0.01). There was intense and diffuse FN staining in all of the CMs. The expression of Ⅳc and αSMA was noted to be intense throughout the 44 vascular malformations studied. The study demonstrated a clear difference in the expression of FN and LM among the different types of vascular malformations. CMs appeared to exhibit immature vessels devoid of LM, consistent with ongoing dysangiogenesis within a FN rich matrix. In contrast, AVMs represented more mature vessels which expressed LM, consistent with dysvasculogenesis.
, 百拇医药
Key words：matrix proteins; arteriovenous malformations; cavernous malformations▲
脑血管畸形是一种先天性疾患。迄今对脑血管畸形的发展演变过程知之甚少。WHO将脑血管畸形分为脑动静脉畸形(AVMs)和海绵状血管瘤(CMs)等5型。最近，有学者提出将混合性血管畸形作为一种独立类型分类，并指出它可能是不同血管畸形之间的过渡型[1]。组织基底膜主要由Ⅳ型胶原蛋白(Ⅳc)、纤维连接蛋白(FN)和层粘蛋白(LM)组成。本研究通过免疫组化染色，观察与分析AVMs和CMs 2类脑血管畸形与4种结构基质蛋白表达的关系，以期加深对脑血管畸形的发病机制认识。
1 材料和方法
5例因癫痫行颞叶切除或皮质造瘘术中相对正常的脑组织血管。5例血管网状细胞瘤标本，经病理学检查证实。AVMs及CMs标本各22例，经手术和术后病理证实。所有标本均为我院1996年9月至1997年12月手术标本。
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LM：兔抗人多克隆抗体(Sigma Immuno Chemicals, USA)；FN：鼠抗人单克隆抗体(Novocastra Laboratories, UK)；Ⅳc：鼠抗人单克隆抗体(ZYMED，USA)；αSMA：鼠抗人单克隆抗体(Novocastra Laboratories, UK)；免疫组化染色SpTM试剂盒(美国ZYMED公司)。
所有标本经10%中性甲醛固定(pH 7.5磷酸缓冲液配制)，常规乙醇脱水，石蜡包埋，6 μm连续切片，封固于多聚赖氨酸玻片。
常规组织学检查：行HE染色及观察。
基质结构蛋白的免疫组化：切片脱蜡至水。3%过氧化氢室温孵育30 min，蒸馏水冲洗，0.01 mol/L PBS(pH 7.5)漂洗，清水冲洗。蛋白酶消化：(LM：0.4%胃蛋白酶消化7 min；FN和Ⅳc：1.0%胰蛋白酶消化7 min；α-SMA：不作消化)。PBS冲洗。以10%正常山羊血清(0.01 mol/L PBS稀释)封闭，室温10 min；倾去血清，PBS漂洗。分别滴加一抗工作液，4 ℃孵育20 min(LM 1∶100；Ⅳc 1∶50；α-SMA 1∶50；FN 1∶100)(空白对照片滴加等量的0.01 mol/L PBS代替一抗)。倾去一抗，PBS冲洗。滴加生物素标记的二抗工作液(1∶300)，室温30 min(LM：抗兔，Ⅳc、SM、FN：抗鼠)。PBS漂洗，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液(三抗，0.01 mol/L PBS配置)，室温孵育30 min。PBS冲洗，DAB(对氨基联苯胺)显色，苏木精复染，脱水，透明，封片，观察。
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观察方法：对照相应普通病理学切片，注意免疫组化切片血管腔的内皮细胞层、AVMs的血管中层及外膜层、CMs的海绵间腔基质，以及血管周围的组织学特点与免疫染色情况，由2位与实验无关的病理科医生观察实验结果，按照同一部位血管着色强度，将结果分为3级：(-)无染色，(+)轻度染色，(2+)明显染色。
统计学处理用SAS软件包，组间比较用χ2检验(精确概率法)。
2 结果
空白对照：所有空白对照均无假阳性发现。
因癫痫做脑叶切除或皮质造瘘术获取的5例正常脑组织血管标本中，LM、Ⅳc及αSMA明显表达，LM位于血管内皮细胞下层，而FN未见表达。5例血管网织细胞瘤中FN、Ⅳc及αSMA明显表达，FN位于血管内皮细胞下层，而LM未见表达。2种标本中Ⅳc及αSMA均位于内皮细胞下层及血管中层。
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在AVMs中LM表达13例呈(-)；9例呈(+)，位于内皮细胞下层；在CMs中均未见表达。2组间存在显著性差异(P<0.05，表1)。
在所有AVMs中FN呈(+)表达，位于内皮细胞、内皮细胞下层及血管外膜层；而在所有CMs中呈(2+)表达，位于血管壁全层，包括内皮细胞、内皮细胞下层及海绵间腔基质，病灶周围血管未见表达。2组间存在显著性差异(P<0.01，表1)。
表1 LM和FN在CMs和AVMs中的染色结果 组别
LM
FN
-
+
-
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AVMs
13
9
22
0
CMs
22
0
0
22
P值
<0.01
<0.01
, 百拇医药
Ⅳc及αSMA在所有AVMs及CMs中均呈(2+)，在AVMs中位于内皮细胞下层及血管中层；在CMs中位于内皮细胞、内皮细胞下层或海绵间腔基质。
3 讨论
Strecter将胚胎早期血管的发育分为5个不同时期，各个时期脑血管的发育障碍，决定血管畸形的类型和部位。通常认为血管形成存在血管系发生和血管生成2种方式，并由不同机制调控[2]；提出AVMs和脑面血管瘤病的血管是由于胚胎早期血管发生不良引起，而CMs是由于进行性血管生成不良所致。临床研究发现AVMs表现为成熟血管壁的成分，与之相对，海绵状血管瘤形态学上表现为缺乏平滑肌层和弹力纤维[3]。近年来在血管生物学研究中发现了许多与血管成熟和内皮细胞活化有关的因子[4，5]，基底膜蛋白即为其中1类。
组织基底膜主要由Ⅳc、FN和LM组成。Ⅳc占总胶原量的7%，构成毛细血管基底膜的60%～90%，对毛细血管壁起到支撑作用[6]。α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)特异性标记α-肌动蛋白平滑肌细胞异构体，αSMA表达显示血管内皮下肌细胞和纤维细胞构成的血管中层。本实验发现，几乎所有AVMs和CMs表达Ⅳc和αSMA的情况相似：在AVMs中和正常血管类似，αSMA和Ⅳc在内皮细胞下层和中层外呈条带状；在CMs中2种蛋白在内皮下层都呈阳性，在海绵窦间腔表达很微弱，没有在AVMs的中层外显示的条带样表达，表明其缺乏胶原结构和平滑肌细胞结构。
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不同血管床基底膜含有不同数量的LM和FN[4，5，7]。FN可以连接内皮细胞及其下方的内弹力层和平滑肌层，刺激内皮细胞形成毛细血管样结构[8，9]，通过引入细胞间粘附分子引起内皮细胞的装配和多细胞性毛细血管形成。因此，FN被认为是血管未成熟的标志[4]。本实验证实FN表达见于全部血管网状细胞瘤，而正常脑组织血管未见表达，证明血管网状细胞瘤血管发生幼稚。微血管的完整性主要是由于LM的作用[10]，它的表达是血管成熟的早期指征[5]。本实验肯定LM在全部正常脑组织血管表达，而在全部血管网状细胞瘤中未见表达，再次证明血管网状细胞瘤血管发育不良。通过研究血管的形成和分化的过程，发现LM和FN是在血管发育的不同时期进入血管结构的[4，5]。一般情况下，未成熟的血管，富含FN基质，与增生性非粘附性内皮细胞相关，缺乏LM的表达；相反，比较成熟的血管，含有粘附性非增生内皮细胞，表达LM，基质中含有少量的FN。本研究结果发现：CMs表现为富含FN基质，缺乏LM成熟血管成分，与其在含FN基质的进行性血管生成障碍一致，可能与其独特的遗传倾向性、出血和胶原环境有关。相反，AVMs表现为表达LM，由较为成熟的血管组成，但在血管连接和排列中存在紊乱，这可能与其胚胎发育早期的血管发生障碍是一致的。本研究提示AVMs和CMs这2种脑血管畸形成熟程度不同，支持Strecter关于脑血管畸形来源于胚胎期脑血管胚芽发育不同时期的理论。
, 百拇医药
参考文献：
[1]Robinson J R, Awad I A, Masary T J, et al. Pathological heterogeneity of angiographically occult vascular malformations of the brain. Neurosurgery, 1993,33:547～554
[2]Chan-Ling T, Halasz P, Stone J. Development of retinal vasculature in the rats: Process and machanisms. Curr Eye Res, 1990,9:459～465
[3]Little J R, Awad I A, Jones S C, et al. Vascular pressures and cortical blood flow in cavernous angioma of the brain. J Neurosurg, 1990,73:555～559
, 百拇医药
[4]Krum J M, More N S, Rosenstein J M. Brain angiogenesis: Varitations in vascular basement membrane glycoprotein immunoreactivity. Exp Neurol, 1991,111:152～165
[5]Risau W, Lemmon V. Changes in the vascular extracellular matrix during embryonic vasculogenesis and angiogenesis. Dev Biol, 1988,125:441
[6]Tamaki M, McDonald W, Del Maestro R F. Release of collagen type Ⅳ degrading activity from C6 astrocytoma cells and cell density. J Neurosurg, 1996,84(6):1013～1019
, 百拇医药
[7]Kittelberger R, Davis P F, Stehbens W E. Distribution of Type Ⅳ collagen, laminin, nidogen and fibronectin in the haemodynamically stressed vascular wall. Histol Histopathol, 1990,5:161～167
[8]Adams J C, Watt F N. Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix. Development, 1993,117:1183～1198
[9]Nguyen M, Strubel N A, Bischoff J. A role for sialy lewis-x/a glycoconjugates in capillary morphogenesis. Nature, 1993,365:267～269
[10]Hamann G F, Okada Y, Fitridge R, et al. Microvascular basal lamina antigens disappear during cerebral ischemia and reperfusion. Stroke, 1995,26(11):2120～2126
收稿日期：1999-03-11, 百拇医药
单位：(首都医科大学附属北京天坛医院神经外科)
关键词：结构基质蛋白；脑动静脉畸形；海绵状血管瘤
首都医科大学学报000117 摘 要：对2种不同类型的脑血管畸形脑动静脉畸形(AVMs)及海绵状血管瘤(CMs)的标本、正常脑组织血管标本、血管网状细胞瘤标本进行免疫组化染色，观察4种血管结构基质蛋白(LM、FN、Ⅳc、αSMA)的表达。结果：LM和FN在AVMs与CMs中的表达不同，均存在显著性差异(P<0.01)；而Ⅳc及αSMA在所有血管中均有表达。结果提示：AVMs血管发育较为成熟，而CMs具有未成熟血管特征。
分类号：R651.1
Expression of Matrix and Structural Proteins
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in Cerebral Vascular Malformations
Yuan Ge Zhao Jizong
(Department of Neurosurgery, Beijing Tiantan Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract：Specimens of 22 cases of arteriovenous malformations (AVMs) and 22 cases of cavernous malformations (CMs) were paraffin-processed with immunohistochemical staining. Four types of matrix and structural proteins (LM, FN, Ⅳc, αSMA) were examined. The results were analyzed by two observes blinded to the antibody and lesion type, and were evaluated in three classes. The AVMs exhibited positive for LM in 9/22, while none of the CMs demonstrated LM expression (P<0.01). By contrast, FN expression was more prominent in CMs than that in AVMs (P<0.01). There was intense and diffuse FN staining in all of the CMs. The expression of Ⅳc and αSMA was noted to be intense throughout the 44 vascular malformations studied. The study demonstrated a clear difference in the expression of FN and LM among the different types of vascular malformations. CMs appeared to exhibit immature vessels devoid of LM, consistent with ongoing dysangiogenesis within a FN rich matrix. In contrast, AVMs represented more mature vessels which expressed LM, consistent with dysvasculogenesis.
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Key words：matrix proteins; arteriovenous malformations; cavernous malformations▲
脑血管畸形是一种先天性疾患。迄今对脑血管畸形的发展演变过程知之甚少。WHO将脑血管畸形分为脑动静脉畸形(AVMs)和海绵状血管瘤(CMs)等5型。最近，有学者提出将混合性血管畸形作为一种独立类型分类，并指出它可能是不同血管畸形之间的过渡型[1]。组织基底膜主要由Ⅳ型胶原蛋白(Ⅳc)、纤维连接蛋白(FN)和层粘蛋白(LM)组成。本研究通过免疫组化染色，观察与分析AVMs和CMs 2类脑血管畸形与4种结构基质蛋白表达的关系，以期加深对脑血管畸形的发病机制认识。
1 材料和方法
5例因癫痫行颞叶切除或皮质造瘘术中相对正常的脑组织血管。5例血管网状细胞瘤标本，经病理学检查证实。AVMs及CMs标本各22例，经手术和术后病理证实。所有标本均为我院1996年9月至1997年12月手术标本。
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LM：兔抗人多克隆抗体(Sigma Immuno Chemicals, USA)；FN：鼠抗人单克隆抗体(Novocastra Laboratories, UK)；Ⅳc：鼠抗人单克隆抗体(ZYMED，USA)；αSMA：鼠抗人单克隆抗体(Novocastra Laboratories, UK)；免疫组化染色SpTM试剂盒(美国ZYMED公司)。
所有标本经10%中性甲醛固定(pH 7.5磷酸缓冲液配制)，常规乙醇脱水，石蜡包埋，6 μm连续切片，封固于多聚赖氨酸玻片。
常规组织学检查：行HE染色及观察。
基质结构蛋白的免疫组化：切片脱蜡至水。3%过氧化氢室温孵育30 min，蒸馏水冲洗，0.01 mol/L PBS(pH 7.5)漂洗，清水冲洗。蛋白酶消化：(LM：0.4%胃蛋白酶消化7 min；FN和Ⅳc：1.0%胰蛋白酶消化7 min；α-SMA：不作消化)。PBS冲洗。以10%正常山羊血清(0.01 mol/L PBS稀释)封闭，室温10 min；倾去血清，PBS漂洗。分别滴加一抗工作液，4 ℃孵育20 min(LM 1∶100；Ⅳc 1∶50；α-SMA 1∶50；FN 1∶100)(空白对照片滴加等量的0.01 mol/L PBS代替一抗)。倾去一抗，PBS冲洗。滴加生物素标记的二抗工作液(1∶300)，室温30 min(LM：抗兔，Ⅳc、SM、FN：抗鼠)。PBS漂洗，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液(三抗，0.01 mol/L PBS配置)，室温孵育30 min。PBS冲洗，DAB(对氨基联苯胺)显色，苏木精复染，脱水，透明，封片，观察。
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观察方法：对照相应普通病理学切片，注意免疫组化切片血管腔的内皮细胞层、AVMs的血管中层及外膜层、CMs的海绵间腔基质，以及血管周围的组织学特点与免疫染色情况，由2位与实验无关的病理科医生观察实验结果，按照同一部位血管着色强度，将结果分为3级：(-)无染色，(+)轻度染色，(2+)明显染色。
统计学处理用SAS软件包，组间比较用χ2检验(精确概率法)。
2 结果
空白对照：所有空白对照均无假阳性发现。
因癫痫做脑叶切除或皮质造瘘术获取的5例正常脑组织血管标本中，LM、Ⅳc及αSMA明显表达，LM位于血管内皮细胞下层，而FN未见表达。5例血管网织细胞瘤中FN、Ⅳc及αSMA明显表达，FN位于血管内皮细胞下层，而LM未见表达。2种标本中Ⅳc及αSMA均位于内皮细胞下层及血管中层。
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在AVMs中LM表达13例呈(-)；9例呈(+)，位于内皮细胞下层；在CMs中均未见表达。2组间存在显著性差异(P<0.05，表1)。
在所有AVMs中FN呈(+)表达，位于内皮细胞、内皮细胞下层及血管外膜层；而在所有CMs中呈(2+)表达，位于血管壁全层，包括内皮细胞、内皮细胞下层及海绵间腔基质，病灶周围血管未见表达。2组间存在显著性差异(P<0.01，表1)。
表1 LM和FN在CMs和AVMs中的染色结果 组别
LM
FN
-
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AVMs
13
9
22
0
CMs
22
0
0
22
P值
<0.01
<0.01
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Ⅳc及αSMA在所有AVMs及CMs中均呈(2+)，在AVMs中位于内皮细胞下层及血管中层；在CMs中位于内皮细胞、内皮细胞下层或海绵间腔基质。
3 讨论
Strecter将胚胎早期血管的发育分为5个不同时期，各个时期脑血管的发育障碍，决定血管畸形的类型和部位。通常认为血管形成存在血管系发生和血管生成2种方式，并由不同机制调控[2]；提出AVMs和脑面血管瘤病的血管是由于胚胎早期血管发生不良引起，而CMs是由于进行性血管生成不良所致。临床研究发现AVMs表现为成熟血管壁的成分，与之相对，海绵状血管瘤形态学上表现为缺乏平滑肌层和弹力纤维[3]。近年来在血管生物学研究中发现了许多与血管成熟和内皮细胞活化有关的因子[4，5]，基底膜蛋白即为其中1类。
组织基底膜主要由Ⅳc、FN和LM组成。Ⅳc占总胶原量的7%，构成毛细血管基底膜的60%～90%，对毛细血管壁起到支撑作用[6]。α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)特异性标记α-肌动蛋白平滑肌细胞异构体，αSMA表达显示血管内皮下肌细胞和纤维细胞构成的血管中层。本实验发现，几乎所有AVMs和CMs表达Ⅳc和αSMA的情况相似：在AVMs中和正常血管类似，αSMA和Ⅳc在内皮细胞下层和中层外呈条带状；在CMs中2种蛋白在内皮下层都呈阳性，在海绵窦间腔表达很微弱，没有在AVMs的中层外显示的条带样表达，表明其缺乏胶原结构和平滑肌细胞结构。
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不同血管床基底膜含有不同数量的LM和FN[4，5，7]。FN可以连接内皮细胞及其下方的内弹力层和平滑肌层，刺激内皮细胞形成毛细血管样结构[8，9]，通过引入细胞间粘附分子引起内皮细胞的装配和多细胞性毛细血管形成。因此，FN被认为是血管未成熟的标志[4]。本实验证实FN表达见于全部血管网状细胞瘤，而正常脑组织血管未见表达，证明血管网状细胞瘤血管发生幼稚。微血管的完整性主要是由于LM的作用[10]，它的表达是血管成熟的早期指征[5]。本实验肯定LM在全部正常脑组织血管表达，而在全部血管网状细胞瘤中未见表达，再次证明血管网状细胞瘤血管发育不良。通过研究血管的形成和分化的过程，发现LM和FN是在血管发育的不同时期进入血管结构的[4，5]。一般情况下，未成熟的血管，富含FN基质，与增生性非粘附性内皮细胞相关，缺乏LM的表达；相反，比较成熟的血管，含有粘附性非增生内皮细胞，表达LM，基质中含有少量的FN。本研究结果发现：CMs表现为富含FN基质，缺乏LM成熟血管成分，与其在含FN基质的进行性血管生成障碍一致，可能与其独特的遗传倾向性、出血和胶原环境有关。相反，AVMs表现为表达LM，由较为成熟的血管组成，但在血管连接和排列中存在紊乱，这可能与其胚胎发育早期的血管发生障碍是一致的。本研究提示AVMs和CMs这2种脑血管畸形成熟程度不同，支持Strecter关于脑血管畸形来源于胚胎期脑血管胚芽发育不同时期的理论。
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参考文献：
[1]Robinson J R, Awad I A, Masary T J, et al. Pathological heterogeneity of angiographically occult vascular malformations of the brain. Neurosurgery, 1993,33:547～554
[2]Chan-Ling T, Halasz P, Stone J. Development of retinal vasculature in the rats: Process and machanisms. Curr Eye Res, 1990,9:459～465
[3]Little J R, Awad I A, Jones S C, et al. Vascular pressures and cortical blood flow in cavernous angioma of the brain. J Neurosurg, 1990,73:555～559
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[4]Krum J M, More N S, Rosenstein J M. Brain angiogenesis: Varitations in vascular basement membrane glycoprotein immunoreactivity. Exp Neurol, 1991,111:152～165
[5]Risau W, Lemmon V. Changes in the vascular extracellular matrix during embryonic vasculogenesis and angiogenesis. Dev Biol, 1988,125:441
[6]Tamaki M, McDonald W, Del Maestro R F. Release of collagen type Ⅳ degrading activity from C6 astrocytoma cells and cell density. J Neurosurg, 1996,84(6):1013～1019
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[7]Kittelberger R, Davis P F, Stehbens W E. Distribution of Type Ⅳ collagen, laminin, nidogen and fibronectin in the haemodynamically stressed vascular wall. Histol Histopathol, 1990,5:161～167
[8]Adams J C, Watt F N. Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix. Development, 1993,117:1183～1198
[9]Nguyen M, Strubel N A, Bischoff J. A role for sialy lewis-x/a glycoconjugates in capillary morphogenesis. Nature, 1993,365:267～269
[10]Hamann G F, Okada Y, Fitridge R, et al. Microvascular basal lamina antigens disappear during cerebral ischemia and reperfusion. Stroke, 1995,26(11):2120～2126
收稿日期：1999-03-11, 百拇医药