HBV与原发性肝癌相关性研究
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作者：朱旺升 龚俊 毛茸 黄利鸣
单位：朱旺升 龚俊 毛茸(湖北三峡学院医学院临床医学系97级02班 宜昌 443003)；黄利鸣(病理解剖学教研室)
关键词：
实用医学进修杂志00zj09
肝癌是世界上最常见的恶性瘤之一，全世界每年发病人数估计约有25万例，居肿瘤的第8位，其发生率在世界各地有显著差异，在亚洲及非洲的大多数发展中国家原发性肝癌(primary hepatocellular carcinomas ,PHC)发生率约为20%，最新的调查研究显示：我国PHC的死亡率为20.37/10万，年新发病例11.02万[1]，严重危害人类生命。目前，大规模的流行病学调查和现代血清学、分子生物学研究发现：PHC与慢性HBV感染之间存在明显的相关性。
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1 流行病学与动物实验
多数PHC病人发病前都有一长期的HBV慢性感染携带状态，不同资料报道的相关性程度不一,大都在50%左右，有的甚至高达97%[1～3]。其支持点有三：①HBV的流行范围与PHC的高发区基本呈一致性分布；这种情况在东南亚地区表现尤为明显。我国启东地区是HBV流行区，也是肝癌高发区[3]; ②在PHC患者的血清中有高比例HBV感染标志；在非洲检测率为70%，在中国高达90%以上，而这些地区的一般人群中的感染阳性率仅10～20%[3，4];③HBV携带者发展为PHC的危险性明显高于正常人；以Beasley氏[3]为代表的前瞻性调查研究发现HBV慢性携带者比未感染HBV者，发生PHC的危险性要高100倍，台湾地区此种危险性可高达到233倍。
动物实验也证实了HBV与PHC之间的相关性。在美洲旱獭、黄鼠狼、北京鸭肝炎模型中，均发现了相应的嗜肝DNA病毒的DNA与宿主细胞整合；Popper报道8只感染了HBV的美洲旱獭，17～36个月内全部发生PHC；土拨鼠实验也得到类似结果。
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2 HBV与PHC相关性的病理学基础
约80～90%的肝癌合并有肝硬化,其中70%～80%为坏死后大结节肝硬变,坏死后大结节型肝硬化主要由病毒性肝炎引起，有70%～80%病例HBsAg阳性。 而肝硬化时20%～25%病例发展为肝癌，且现在认为肝硬变的机会和其HBsAg阳性有关。HBsAg阳性的肝硬化发生肝癌的机会为51%， 而HBsAg阴性者为15%[5]。此外吴绮明[6]等用免疫组化学技术(LSAB)法检测70例PHC组织标本有62.5%的癌旁肝组织HBsAg阳性表达。肝细胞炎症、坏死促进肝硬化形成和肝细胞增生，而后者又可使肝细胞癌性转变的频率增加；同时，肝细胞的坏死又可诱变其有丝分裂，分裂期的DNA和核蛋白易于产生致癌性转化的DNA改变，当肝细胞分化有丝分裂期染色体对重组敏感，可导致整合HBV DNA肝细胞数增加，在发生一系列HBV DNA与宿主DNA序列的重组之后，产生有遗传特性的异常肝细胞，引起细胞转化；随后是单克隆选择性分化，最后发展为PHC。
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3 PHC与慢性HBV感染相关性分子生物学基础
流行病学和病理学为PHC与慢性HBV感染相关性提供了大量的事实证据，人们开始对HBV至PHC的具体诱导机制进行了深入的研究。随着转基因小鼠的建立和应用，使其在分子生物学上有了很大进展。目前，这方面的研究主要包括①HBV-DNA的直接整合作用；②HBV-DNA各基因片段的具体作用：S，X基因的反式激活作用使某些癌基因失活及抑癌基因功能受阻。更发现了这些基因产物对IGF-II、TGF-α等的作用在癌变中发挥了重要作用。
3.1 HBV DNA整合与PHC
在慢性活动性乙型肝炎(CAHB)病程中，HBV DNA以低频率随机整合入肝细胞基因组DNA(gDNA)。病毒整合引起的病毒和细胞DNA序列的缺失、重排、转位或扩增，最终导致染色体畸变。HBV DNA整合可能使染色体失稳而易于丢失。
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关于HBV DNA整合的研究在分子水平上为HBV的致癌作用提供了进一步证据。Sherman和Shfritz[5]提出肝细胞的癌变可能为一长期过程。他们设想，在急性、慢性肝炎或持续携带HBsAg期间，HBV DNA整合到宿主染色体中。宿主的免疫系统可清除发生HBV复制的肝细胞，而含有整合HBV DNA的肝细胞则可以逃避免疫监视而优先存活下来，随着这些细胞的不断增生，产生有异常遗传特性的肝细胞，即细胞转化，最终发展为PHC。
3.2 HBV与PHC相关性的分子生物学
3.2.1 S基因区 S基因区包括三个基因区，即PreS1,PreS2和S区，它们编码了大、中、小三种蛋白，即IP、MP、SP。在肝癌组织内HBsAg、preHBsAg检出率较低，分别为10～15%和20%，且多见于分化较好的肝癌组织中；而癌周组织两者的检出率较高，为60～80%和60%，两者阳性产物多位于胞浆内，但其分布随个体、部位不同而有较大差异[4]。传统研究认为HBsAg和preHBsAg是作为靶抗原，通过免疫反应造成肝细胞的损伤,然后增生(不典型增生)，最终导致癌变。但最近有人研究发现[4]两者均具有反式激活作用，且和PHC相关，Dragan氏在其转染HBsAg阳性小鼠与转染HBsAg阴性小鼠之后，再将其暴露于同一致癌原时，结果发现前者PHC发生的个数与速度明显高于后者[3]。此外，亦有许多实验证实HBsAg单抗的抑癌作用优于人PHC单抗，这提示HBsAg在PHC的发生发展中扮演重要角色[3]。PerS2可通过反式激活作用激活肝细胞的癌基因c-myc、c-fos、c-jun[7]。成军[8]报道由preS2与S基因共同编码的MP在其羟基端去掉9个(or>9个)氨基酸残基后,具有反式激活作用。
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另外，前S基因区常有多处突变，其突变后表达的异常比例的蛋白在PHC的了生中起重要作用。美国Chisari[9]将小鼠白蛋白基因和HBV前S基因注入受精卵得到转基因小鼠后，2个月即见肝细胞毛玻璃样变，电镜下看到内质网有大量S抗原而扩张，继而肝细胞发生坏死，6个月出现再生结节，12个月可见不典型增生，18个月相继出现PHC。日本小池克郎[10]认为前S1/S2白之大量表达及其在细胞的蓄积是引发癌变一系列过程的扳机。
3.2.2 前C、C基因区 前C、C基因区编码产物为HBcAg、HBeAg。许多研究发现前C区的终止密码突变可造成HBeAg分泌下降，导致机体免疫逃避，造成持续感染而使PHC危险性升高。陈子平，闻玉梅首次在我国HBVadr亚型患者中检出C区的终止密码突变(第1898位核苷酸)；龚常勇等对31例PHC患者血清分析发现11例HBV DNA(+),其中2例C基因前C区28位发生变异，5例C区L97发生变异，表明PHC不仅存在HBV，且可有HBV变异株存在[3,11]。
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3.2.3 X基因 HBV X基因位于核苷酸(nt)1372-1834之间，是HBV DNA中最小的一个开发阅读框架(ORI), 编码HBxAg。X蛋白质本身并不具有DNA结合能力，但有对病毒和细胞基因表达的转化调节作用[12]。Shirasata等及Hohne等报告称，X基因具有诱癌变能力。迄今有不少研究者制成导入HBV-DNA的转基因小鼠，但无X基因表达者皆未诱发生癌。
X蛋白反式激活的靶细胞基因有P53、IGF-II、c-mys、c-fas、N-ras、ets-2、Ha-ras等[13]。X蛋白通过蛋白-蛋白相互作用而作用于DNA结合蛋白质(转录因子)，直接或间接作用于基因启动子/增强子而发挥转活化功能。Tasada研究发现了X蛋白质之部分氨基酸序列与Kunit2型丝氯酸蛋白酶抑制剂活性上重要的Kunit2结构域(K1结构域)的相同性，其主要氨其酸如发生突变，转活化功能即完全消失，故K1结构域对X蛋白功能来讲是极为重要的部分[14]。
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野生型P53基因是一种抑癌基因，具有转录激活，诱导细胞凋亡和调节细胞周期等功能，可使DNA损伤的细胞发生凋亡。当野生型P53存在时可促进其介导的不依赖转录激活作用的细胞凋亡，防止癌细胞形成。以前认为，P53基因结构上的变化在HBV相关的HCC中是主要原因，但最近的研究表明，HBxAg与P53蛋白结合导致P53功能失活与PHC发生更为密切[15]。HBV是第5个病毒编码产物能与P53蛋白结合的DNA病毒。朱明华等在目前研究的基础上，应用细胞内P53蛋白水平调控的报道基因CDA质粒PGBCAT，与HBx和P53作共转染，结果表明当增加HBx量时，CAT信号逐渐增强，应用地塞米松可诱导的重组质粒PMAMHBx,当诱导HBx表达时，CAT信号亦增强，表明HBx表达可增加P53蛋白在细胞内的含量，当P53蛋白与HBxAg形成复合物后，P53蛋白在胞浆内含量增加，使P53蛋白进入细胞核发挥正常负调节功能的过程受影响。P53介导凋亡发生的能力被X蛋白抑制。因此，HBX/P53的表达水平可能影响到HBV感染肝细胞凋亡与增殖的比例，是HBV感染的肝细胞发生恶性转化的原因之一[16]。
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对HBVxAg基因产物HBxAg的检测发现，在其阳性的与肝硬化中，IGF-II的阳性率明显增高，而HBxAg 阴性组织中IGF-II阳性率较低，且在Edmondson-II 级III级肝癌中，HBVxAg表达较弱而IGF-II可呈强阳性，癌旁肝和肝硬化中HBxAg强阳性的IGF-II较弱，因此HBV可能通过HBxAg的反式调节机制激活IGF-II基因，IGF-II的过度表达使肝细胞恶性增强，而IGF-II的表达对HBVx基因可能抑制作用[17]。IGF-II由67个氨基酸组成，分子量约为7.5KD单链多肽。杨冬华等人的研究表明，转导入PICF-IIAs细胞S3期增多，而对照组SMMC-7721细胞和PCDNA3空载体的SMMC-7721细胞则无抑制肝癌细胞株SMMC-7721细胞则无明显变化。PICF-IIAs反义RNA体外可抑制肝癌细胞株SMMC-7721致瘤性进一步从反面证明了IGF-II持续表达可能是肝癌的致癌机制之一[18]。
除P53、IGF-II外，X基因或HBxAg还可使P16、TGF-α等异常表达，P16蛋白表达低有促进PHC增殖的作用， TGF-α的表达可能是肝细胞癌变的早期过程[6,19,20]。
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4 问题与展望
关于HBV与PHC的相关性及其致癌模式，国内外学者提出了众多的假说，现有3个模式较为引人注目：①病毒-DNA插入激活细胞基因(顺式作用)；②Virus产物激活细胞基因(反式作用)③Popper的多阶段多因素模式。前两个模式已作详述，现就Popper模式作一简单介绍。Popper等人认为：肝细胞的癌变是一个渐进的过程。HBV-DNA整合入C-DNA仅是一个起始过程；它不足单独引起细胞转化；随后，整合有V-DNA仅是一个起始过程,它不足以单独引起细胞转化；随后，整合有V-DNA的肝细胞因无病毒复制表达抗原而逃避机体免疫攻击并且大量增生，故处于有丝分裂期的染色体对DNA重组较敏感，因而V-DNA与C-DNA发生重组继而导致细胞转化，转化后的细胞在宿主内环境及外环境的多种因素作用下，最终导致癌变[21]。最近，有资料[22]表明HBV上调HepG2细胞端粒酶活性(端粒酶是一种能延长细胞端粒未端的核酸蛋白酶)可能是HBV诱发肝细胞癌的另一机制。以上各个模式虽都有一定的实验依据，但都不能完美解释致癌机理的各种现象。因此，在今后的研究工作有几点需进一步发展完善：①基因谱的全面揭示以深入认识癌基因和抑癌基因的作用；②对HBVx基因、S基因等发挥其反式激活功能的具体途径和正确机制的探讨；③对HBVx基因、S基因等自身的生物化学、生物功能和作用的全面深入细致的研究；④使动物实验的许多结果可以在人体内得到证实而不会产生对人体额外的损害。此外，在肝细胞恶性转化中，与HBV感染协同作用的重要因子的确定和研究，也需进一步开展研究。有实验[23]表明，HBV作为独立的致癌因素时作用较弱，但HBV与黄曲霉素B1(AFB)有很强的致癌作用。在PHC的形成过程中可能存在“病毒-化学协同机制”。同时，HCV及其与HBV重叠感染致PHC的可能性也越来越受重视[1,2]。
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参考文献
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单位：朱旺升 龚俊 毛茸(湖北三峡学院医学院临床医学系97级02班 宜昌 443003)；黄利鸣(病理解剖学教研室)
关键词：
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肝癌是世界上最常见的恶性瘤之一，全世界每年发病人数估计约有25万例，居肿瘤的第8位，其发生率在世界各地有显著差异，在亚洲及非洲的大多数发展中国家原发性肝癌(primary hepatocellular carcinomas ,PHC)发生率约为20%，最新的调查研究显示：我国PHC的死亡率为20.37/10万，年新发病例11.02万[1]，严重危害人类生命。目前，大规模的流行病学调查和现代血清学、分子生物学研究发现：PHC与慢性HBV感染之间存在明显的相关性。
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1 流行病学与动物实验
多数PHC病人发病前都有一长期的HBV慢性感染携带状态，不同资料报道的相关性程度不一,大都在50%左右，有的甚至高达97%[1～3]。其支持点有三：①HBV的流行范围与PHC的高发区基本呈一致性分布；这种情况在东南亚地区表现尤为明显。我国启东地区是HBV流行区，也是肝癌高发区[3]; ②在PHC患者的血清中有高比例HBV感染标志；在非洲检测率为70%，在中国高达90%以上，而这些地区的一般人群中的感染阳性率仅10～20%[3，4];③HBV携带者发展为PHC的危险性明显高于正常人；以Beasley氏[3]为代表的前瞻性调查研究发现HBV慢性携带者比未感染HBV者，发生PHC的危险性要高100倍，台湾地区此种危险性可高达到233倍。
动物实验也证实了HBV与PHC之间的相关性。在美洲旱獭、黄鼠狼、北京鸭肝炎模型中，均发现了相应的嗜肝DNA病毒的DNA与宿主细胞整合；Popper报道8只感染了HBV的美洲旱獭，17～36个月内全部发生PHC；土拨鼠实验也得到类似结果。
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2 HBV与PHC相关性的病理学基础
约80～90%的肝癌合并有肝硬化,其中70%～80%为坏死后大结节肝硬变,坏死后大结节型肝硬化主要由病毒性肝炎引起，有70%～80%病例HBsAg阳性。 而肝硬化时20%～25%病例发展为肝癌，且现在认为肝硬变的机会和其HBsAg阳性有关。HBsAg阳性的肝硬化发生肝癌的机会为51%， 而HBsAg阴性者为15%[5]。此外吴绮明[6]等用免疫组化学技术(LSAB)法检测70例PHC组织标本有62.5%的癌旁肝组织HBsAg阳性表达。肝细胞炎症、坏死促进肝硬化形成和肝细胞增生，而后者又可使肝细胞癌性转变的频率增加；同时，肝细胞的坏死又可诱变其有丝分裂，分裂期的DNA和核蛋白易于产生致癌性转化的DNA改变，当肝细胞分化有丝分裂期染色体对重组敏感，可导致整合HBV DNA肝细胞数增加，在发生一系列HBV DNA与宿主DNA序列的重组之后，产生有遗传特性的异常肝细胞，引起细胞转化；随后是单克隆选择性分化，最后发展为PHC。
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3 PHC与慢性HBV感染相关性分子生物学基础
流行病学和病理学为PHC与慢性HBV感染相关性提供了大量的事实证据，人们开始对HBV至PHC的具体诱导机制进行了深入的研究。随着转基因小鼠的建立和应用，使其在分子生物学上有了很大进展。目前，这方面的研究主要包括①HBV-DNA的直接整合作用；②HBV-DNA各基因片段的具体作用：S，X基因的反式激活作用使某些癌基因失活及抑癌基因功能受阻。更发现了这些基因产物对IGF-II、TGF-α等的作用在癌变中发挥了重要作用。
3.1 HBV DNA整合与PHC
在慢性活动性乙型肝炎(CAHB)病程中，HBV DNA以低频率随机整合入肝细胞基因组DNA(gDNA)。病毒整合引起的病毒和细胞DNA序列的缺失、重排、转位或扩增，最终导致染色体畸变。HBV DNA整合可能使染色体失稳而易于丢失。
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关于HBV DNA整合的研究在分子水平上为HBV的致癌作用提供了进一步证据。Sherman和Shfritz[5]提出肝细胞的癌变可能为一长期过程。他们设想，在急性、慢性肝炎或持续携带HBsAg期间，HBV DNA整合到宿主染色体中。宿主的免疫系统可清除发生HBV复制的肝细胞，而含有整合HBV DNA的肝细胞则可以逃避免疫监视而优先存活下来，随着这些细胞的不断增生，产生有异常遗传特性的肝细胞，即细胞转化，最终发展为PHC。
3.2 HBV与PHC相关性的分子生物学
3.2.1 S基因区 S基因区包括三个基因区，即PreS1,PreS2和S区，它们编码了大、中、小三种蛋白，即IP、MP、SP。在肝癌组织内HBsAg、preHBsAg检出率较低，分别为10～15%和20%，且多见于分化较好的肝癌组织中；而癌周组织两者的检出率较高，为60～80%和60%，两者阳性产物多位于胞浆内，但其分布随个体、部位不同而有较大差异[4]。传统研究认为HBsAg和preHBsAg是作为靶抗原，通过免疫反应造成肝细胞的损伤,然后增生(不典型增生)，最终导致癌变。但最近有人研究发现[4]两者均具有反式激活作用，且和PHC相关，Dragan氏在其转染HBsAg阳性小鼠与转染HBsAg阴性小鼠之后，再将其暴露于同一致癌原时，结果发现前者PHC发生的个数与速度明显高于后者[3]。此外，亦有许多实验证实HBsAg单抗的抑癌作用优于人PHC单抗，这提示HBsAg在PHC的发生发展中扮演重要角色[3]。PerS2可通过反式激活作用激活肝细胞的癌基因c-myc、c-fos、c-jun[7]。成军[8]报道由preS2与S基因共同编码的MP在其羟基端去掉9个(or>9个)氨基酸残基后,具有反式激活作用。
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另外，前S基因区常有多处突变，其突变后表达的异常比例的蛋白在PHC的了生中起重要作用。美国Chisari[9]将小鼠白蛋白基因和HBV前S基因注入受精卵得到转基因小鼠后，2个月即见肝细胞毛玻璃样变，电镜下看到内质网有大量S抗原而扩张，继而肝细胞发生坏死，6个月出现再生结节，12个月可见不典型增生，18个月相继出现PHC。日本小池克郎[10]认为前S1/S2白之大量表达及其在细胞的蓄积是引发癌变一系列过程的扳机。
3.2.2 前C、C基因区 前C、C基因区编码产物为HBcAg、HBeAg。许多研究发现前C区的终止密码突变可造成HBeAg分泌下降，导致机体免疫逃避，造成持续感染而使PHC危险性升高。陈子平，闻玉梅首次在我国HBVadr亚型患者中检出C区的终止密码突变(第1898位核苷酸)；龚常勇等对31例PHC患者血清分析发现11例HBV DNA(+),其中2例C基因前C区28位发生变异，5例C区L97发生变异，表明PHC不仅存在HBV，且可有HBV变异株存在[3,11]。
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3.2.3 X基因 HBV X基因位于核苷酸(nt)1372-1834之间，是HBV DNA中最小的一个开发阅读框架(ORI), 编码HBxAg。X蛋白质本身并不具有DNA结合能力，但有对病毒和细胞基因表达的转化调节作用[12]。Shirasata等及Hohne等报告称，X基因具有诱癌变能力。迄今有不少研究者制成导入HBV-DNA的转基因小鼠，但无X基因表达者皆未诱发生癌。
X蛋白反式激活的靶细胞基因有P53、IGF-II、c-mys、c-fas、N-ras、ets-2、Ha-ras等[13]。X蛋白通过蛋白-蛋白相互作用而作用于DNA结合蛋白质(转录因子)，直接或间接作用于基因启动子/增强子而发挥转活化功能。Tasada研究发现了X蛋白质之部分氨基酸序列与Kunit2型丝氯酸蛋白酶抑制剂活性上重要的Kunit2结构域(K1结构域)的相同性，其主要氨其酸如发生突变，转活化功能即完全消失，故K1结构域对X蛋白功能来讲是极为重要的部分[14]。
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野生型P53基因是一种抑癌基因，具有转录激活，诱导细胞凋亡和调节细胞周期等功能，可使DNA损伤的细胞发生凋亡。当野生型P53存在时可促进其介导的不依赖转录激活作用的细胞凋亡，防止癌细胞形成。以前认为，P53基因结构上的变化在HBV相关的HCC中是主要原因，但最近的研究表明，HBxAg与P53蛋白结合导致P53功能失活与PHC发生更为密切[15]。HBV是第5个病毒编码产物能与P53蛋白结合的DNA病毒。朱明华等在目前研究的基础上，应用细胞内P53蛋白水平调控的报道基因CDA质粒PGBCAT，与HBx和P53作共转染，结果表明当增加HBx量时，CAT信号逐渐增强，应用地塞米松可诱导的重组质粒PMAMHBx,当诱导HBx表达时，CAT信号亦增强，表明HBx表达可增加P53蛋白在细胞内的含量，当P53蛋白与HBxAg形成复合物后，P53蛋白在胞浆内含量增加，使P53蛋白进入细胞核发挥正常负调节功能的过程受影响。P53介导凋亡发生的能力被X蛋白抑制。因此，HBX/P53的表达水平可能影响到HBV感染肝细胞凋亡与增殖的比例，是HBV感染的肝细胞发生恶性转化的原因之一[16]。
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对HBVxAg基因产物HBxAg的检测发现，在其阳性的与肝硬化中，IGF-II的阳性率明显增高，而HBxAg 阴性组织中IGF-II阳性率较低，且在Edmondson-II 级III级肝癌中，HBVxAg表达较弱而IGF-II可呈强阳性，癌旁肝和肝硬化中HBxAg强阳性的IGF-II较弱，因此HBV可能通过HBxAg的反式调节机制激活IGF-II基因，IGF-II的过度表达使肝细胞恶性增强，而IGF-II的表达对HBVx基因可能抑制作用[17]。IGF-II由67个氨基酸组成，分子量约为7.5KD单链多肽。杨冬华等人的研究表明，转导入PICF-IIAs细胞S3期增多，而对照组SMMC-7721细胞和PCDNA3空载体的SMMC-7721细胞则无抑制肝癌细胞株SMMC-7721细胞则无明显变化。PICF-IIAs反义RNA体外可抑制肝癌细胞株SMMC-7721致瘤性进一步从反面证明了IGF-II持续表达可能是肝癌的致癌机制之一[18]。
除P53、IGF-II外，X基因或HBxAg还可使P16、TGF-α等异常表达，P16蛋白表达低有促进PHC增殖的作用， TGF-α的表达可能是肝细胞癌变的早期过程[6,19,20]。
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4 问题与展望
关于HBV与PHC的相关性及其致癌模式，国内外学者提出了众多的假说，现有3个模式较为引人注目：①病毒-DNA插入激活细胞基因(顺式作用)；②Virus产物激活细胞基因(反式作用)③Popper的多阶段多因素模式。前两个模式已作详述，现就Popper模式作一简单介绍。Popper等人认为：肝细胞的癌变是一个渐进的过程。HBV-DNA整合入C-DNA仅是一个起始过程；它不足单独引起细胞转化；随后，整合有V-DNA仅是一个起始过程,它不足以单独引起细胞转化；随后，整合有V-DNA的肝细胞因无病毒复制表达抗原而逃避机体免疫攻击并且大量增生，故处于有丝分裂期的染色体对DNA重组较敏感，因而V-DNA与C-DNA发生重组继而导致细胞转化，转化后的细胞在宿主内环境及外环境的多种因素作用下，最终导致癌变[21]。最近，有资料[22]表明HBV上调HepG2细胞端粒酶活性(端粒酶是一种能延长细胞端粒未端的核酸蛋白酶)可能是HBV诱发肝细胞癌的另一机制。以上各个模式虽都有一定的实验依据，但都不能完美解释致癌机理的各种现象。因此，在今后的研究工作有几点需进一步发展完善：①基因谱的全面揭示以深入认识癌基因和抑癌基因的作用；②对HBVx基因、S基因等发挥其反式激活功能的具体途径和正确机制的探讨；③对HBVx基因、S基因等自身的生物化学、生物功能和作用的全面深入细致的研究；④使动物实验的许多结果可以在人体内得到证实而不会产生对人体额外的损害。此外，在肝细胞恶性转化中，与HBV感染协同作用的重要因子的确定和研究，也需进一步开展研究。有实验[23]表明，HBV作为独立的致癌因素时作用较弱，但HBV与黄曲霉素B1(AFB)有很强的致癌作用。在PHC的形成过程中可能存在“病毒-化学协同机制”。同时，HCV及其与HBV重叠感染致PHC的可能性也越来越受重视[1,2]。
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