董晓雅 潘光锦 刘加军

    30多年前小鼠胚胎干细胞的发现开启了人类对于多能干细胞研究的新篇章[1]。至1998年，人胚胎干细胞(hESCs)的发现则为人类再生医学的发展带来了新的希望。目前，我们已能在体外培养由未着床的胚胎内细胞团分离的hESCs，并使其长期维持在未分化的状态。CD34+造血前体细胞在血液病的临床和基础研究中具有潜在的优势。首先，血液系统分级明显，所有血液前体细胞及各类型成熟血液细胞均可由造血干细胞分化发育而来，而对各类细胞我们已有一定程度的了解。其次，体外建立hESCs向造血前体细胞分化的模型有助于我们研究造血早期发育的过程，而此前由于该过程开始于胚胎发育第一周，受条件所限我们很难详细研究。第三，高效的体外诱导分化体系的建立将有助于研究各类血液系统疾病的发生与发展，而诱导得到的造血前体细胞将有可能最终应用于临床造血干细胞的移植[2]。经由hESCs模拟的体外诱导造血发育已先后在多个体系中实现，主要方法包括形成拟胚体的方法，与各类基质细胞系共培养的方法，以及二维单层诱导的方法[3-5]。每种方法均各有特点，鉴于此，我们利用实验室现有资源，对比hESCs/OP9共培养方法和二维单层诱导方法在诱导效率上的差异，以期为后续的早期造血发育研究打好基础。

    材料与方法

    一、细胞系及主要试剂

    hESCs系H1、小鼠骨髓基质细胞系OP9、人胚胎干细胞完全培养基、胚胎干细胞基质胶、胎牛血清、重组人骨形态发生蛋白-4及重组人碱性成纤维细胞生长因子均由中国医学科学院广州健康研究院提供。

    二、方 法

    1.H1的传代培养方法

    选用hESCs完全培养基mTeSR1做常规培养，H1细胞经乙二胺四乙酸(EDTA)处理后，以1∶3～4的比例接种于hESCs基质胶Matrigel(MG)包被的6孔板中，置于5% 二氧化碳、37℃培养箱中培养，每日换液，4 d传一代，将细胞维持在未分化状态[6]。

    2.OP9的传代培养方法

    用含20%胎牛血清的Alpha-MEM培养液常规培养，OP2细胞用0.25%胰酶消化后，以1∶5的比例接种于0.1% 明胶包被的10 cm盘中，置于5% 二氧化碳、37℃培养箱中培养，4 d传一代，传代间期不换液[7]。

    3.hESCs/OP9共培养方法

    将未分化的H1在MG包被的6孔板中培养3～4 d ......