三种差异表达基因克隆方法的比较
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与方法编者按:分子生物学理论和技术引入中医学研究领域10多年来,已经渗透到中医学理论体系和临床各学科中,对中医药学的现代化进程产生了积极的推动作用。21世纪是生物医学发展的重要时期,随着人类基因组计划的完成,人类从基因水平上认识疾病、诊断疾病和治疗疾病的时代已经开始变成现实。从基因水平探讨中医、针灸基础理论的实质,是中医、针灸有希望取得突破的研究途径。为适应当前针灸工作者进行基因分离、筛选、鉴定科研工作的需要,本刊特选登此文。
[摘 要] 为了能快速、有效、准确地克隆出有意义的基因,本文就常用的三种基因克隆方法,即差异显示PCR、抑制性消减杂交、PAP-PCR,从其原理、应用、优越性、主要缺陷等几方面进行了简要概述。这些方法为中医、针刺治疗各种疾病过程中有关的基因差异表达,以及有关基因分子克隆提供有效的分子生物学工具。
[主题词] 针灸原理;基因表达;克隆,分子;聚合酶链反应ComparisonamongThreeDifferentialExpressionGeneCloningMethodsZhangXue
chao,SunGuojie(HubeiCollegeofTCM,Wuhan430061)[Abstract] Theprinciple,application,advantagesanddisadvantagesofthecommonlyusedthreecloninggenemethods,i.e.,differentialdisplayreversetranscriptasePCR(DDRTPCR),suppressionsubtractivehybridization(SSH)andRNAarbitrarilyp
rimedPCR(RAPPCR)arebrieflyintroductedinordertoclonesignificantgenesrapidly,effectivelya
ndaccurately.Thesemethodsprovideeffectivemolecularbiologictoolsfordifferent
ialexpressionofgeneandmolecularcloningofgeneintreatmentofdiseaseswithtraditional
Chinesemedicineandacupuncturemoxibustion.
[Keywords]AcupMoxMechanism;GeneExpression;Cloning,Molecular;PolymeraseChainReaction
高等生物大约有100000个不同的基因,但在生物体内任一细胞中只有15%的基因得以表达。而这大约15000个基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行着,这种表达方式即为基因的差别表达(differentialexpression)[1]。生物体表现出各种各样的特性,主要是其基因表达的差异引起的。基因差异表达的变化有两种,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。由于基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制,通过比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信息。当前,人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移,一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(postgenomics),即功能基因组(functionalgenomics)时代即将到来,这就决定了寻找差异表达基因成为分子生物学的研究热点之一。
目前已有针灸科研工作者从分子生物学水平探讨针灸治疗各种疾病的可能机理。有实验[2]报道针刺翳风等穴位面神经组织中NT3及TrKCmRNA表达增加;针刺后癫痫大鼠海马内nNOSmRNA和iNOSmRNA增加[3];针刺可调节CCK8mRNA、THmRNA、SOMmRNA、cfos\cjunmRNA、CGRPmRNA的增减[4]。为适应当前医学的发展,为满足针灸科研工作者分子生物学研究的需要,本文对差异显示PCR、抑制性消减杂交及RNA任意引物PCR三种常用的差异基因筛选法,分别从其基本原理、过程、应用范围及优缺点等作一个简介。
1 差异显示PCR(differentialdisplayreversetranscriptasePCR,DDRTPCR)
该方法是自1992年由Liang和Pardee建立起来的[1],后经多年改进,目前已被广泛的使用。它已较成功地用于胚胎发生[5]、脑发育[6]、生长因子激活与抑制、信号传导[7]、癌症[8]等有关的基因的鉴定与克隆。其主要原理是:利用mRNAs结尾处的多聚腺苷酸[poly(A)]结构,在其3｀端设计如5｀T11CA排列样的锚定引物,该引物可与mRNAs总数的十二分之一[即poly(A)前面2个碱基为TG的mRNA]结合,从而使这部分基因得到逆转录;而一套(即T11MN,N代表任意碱基,M为除T外的其他三种碱基,共12条)引物可将全部mRNA得到扩增。在其5｀端再设计一些任意碱基序列的引物,就可使不同长度的基因得到扩增。
DDRTPCR包括3个基本步骤:①用一套锚定引物反转录样本mRNA为cDNA;
②用一套随机图1DDRT-PCR过程引物和锚定引物扩增cDNA;③电泳分离产生PCR片段。由图1可知,条带2、5分别为不同组织A、B所特有。将差别表达条带进行回收、鉴定分析,即可获得差异表达的目的基因。
DDRTPCR具有简便、快捷、所需起始材料少;由于PCR技术的应用,使得低丰度mRNA的筛选成为可能;可同时对多个样本进行比较;可检测基因的上游调节和下游调节。但其缺点是假阳性条带太多,有时甚至高达85%[9],而且重复性差;获得的差异片段较短,因而在Northernblot检测时往往得不到杂交信号。
2 抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)
消减杂交最早由Lamar和Palmer于1984年报道[10],后经多年的改进,它已发展为许多基因克隆方法的基础,SSH就是其中之一[11]。该方法运用杂交动力学原理,即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA,并同时利用链内退火优先于链间退火的特性,从而选择性地抑制了非目的片段的扩增。其基本过程(见图2)为将tester(样本)mRNA和driver(参照)mRNA分别逆转录为cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)酶切两种cDNA产生平端片段;testercDNA分别接上adapter(接头)1及adapter2并与过量的经RsaI酶消化的driver样本杂交。引物设计在adapter上,这样仅使具有差异表达的片段成为PCR的模板,同时接头上含有启动子序列及限制性内切酶识别位点,为以后连接克隆载体和测序提供方便。经过重复消减杂交以便减少非特异性片段的扩增,使得差异表达的目的基因片段得到大量富集。
该方法具有高度的灵敏性、假阳性率低、分离的差异条带多。然而其仅能比较成对RNA群体间差异表达的基因,起始材料要求较多、对小片段缺失的样本无法检出,由于稀有mRNA不适合杂交动力学而使这部分基因漏掉,通过使用driver序列和tester序列彻底杂交的扣除方法可以避免非差异表达的序列,但副作用是使那些不按“全或无”模式表达的基因之间的明显差异变化变得模糊,并还存在adapter与cDNA片段的连接效率问题等。但SSH仍不失是目前较有效的克隆目的基因的方法之一[12,13]。
3 RNA任意引物PCR(RNAarbitrarilyprimedPCR,RAPPCR)
RAPPCR方法与DDRTPCR同时报道[14],其基本原理也较为一致。但其具体使用方法与DDRTPCR不同。首先,用任意引物在RNA模板和其配对最好的位点进行反转录合成第一链cDNA或者在反转录的第一步即加入5｀随机引物与3｀锚定引物,如果RNA具有6～8个碱基与该5｀引物的3｀端相匹配,则该随机引物同样能引导cDNA第一链的合成。这样,通过两种引物的反转录即可以研究所有RNA,包括开放阅读框(openreadingframe,ORF)。第二链是在任意引物所找到的最佳配对位点起始合成。在扩增序列引物和模板配对比较差的一端,可以由极好配对的另一端得到补偿。以上的结果是收集了在3｀和5｀端侧翼有和任意引物相同的序列(互补的序列)的基因片段。这些片段可作为模板进行高严谨性的PCR扩增,最终得到与基因组DNA指纹(DNAfingerprinting)相似的指纹。因此该方法也称为RNA指纹技术(RNAfingerprintingtechnique)。凝胶电泳可以显示全部PCR产物,再从中回收差异表达的基因片段,进行克隆、测序及功能分析。其基本步骤如图3。图中条带A、C为组织1或2特有的,B为不同组织表达量差异的条带。图3RAP-PCR基本过程
该技术经过多年的应用和改进,利用此方法有人已成功的寻找到一种新的神经膜蛋白基因[15]、并在某些疾病相关基因[16]、信号传导相关的调节基因等方面得到广泛的应用[17～19]。有实验表明,RAPPCR在一定的反应条件下,重复性相当好,可达90%。RNA的浓度、DNA的污染等均对结果无明显影响;组间条带的亮度差异在20%以上即可定为基因的差异表达[20]。与DDRTPCR、SSH比较,该方法有其独特的优点:首先,RAPPCR可以同时比较2个以上的RNA样本,并且来自各式各样的调控种类的基因能直接克隆。因此,对于任何被观察到的差异片段,能分析许多因素的影响。其次,以PCR为基础的RNA指纹分析方法另一个优点是可以在几天内产生结果,而不像DDRTPCR及SSH那样需要许多步骤,花几周时间。再次,由于长序列随机引物的应用大大降低了假阳性条带的出现。另外,RAPPCR灵敏高、起需起始材料少。尽管RAPPCR具有诸多的优点,但该方法需要较高的变性温度和较低的离子强度;并且随机引物并非选择性扩增的专一目标,有可能正好在某一类基因的保守区或分散的基因重复序列区,这样有可能只扩增这一类基因。象其他方法一样,RAPPCR电泳产物的回
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