人纤溶酶原Ｋ5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定
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[摘要] 目的 构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞株MDA—MB—231，观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV304和MDA—MB—231田胞增殖的影响。方法 应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5 cDNA，所得的目的片段与真核表达载体pcDNA3重组，构建重组质粒pcDNA3K5，脂质体法将其转染MDA-MB-231，(G418筛选阳性克隆，PCR鉴定，RT-PCR和Western blot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞，MTT法检测其增殖情况，并用MTT法检测转染pcDNA3K5对MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果 构建的重组质粒pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确，将其转染MnA-MD-231后挑取的阳性克隆有3个经PCR鉴定正确，并经RT-PCR和Western blot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于EC3V304细胞后，其存活率降低；转染pcDNA3K5对MDA-MB-231田胞增殖无明显影响。结论 应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5 cDNA转染MDA-MB-231细胞后，其分泌产生的有生物学活性的K5，呈现对ECV304细胞增殖的抑制作用，而对MDA-MB—231田胞的生长则无影响。
[关键词] 重组新生血管生成抑制因子K5； 乳腺癌； 基因治疗
[中国图书馆分类法分类号] Q 78
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