ＰＴＤ－Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ Ｄ28Ｋ融合蛋白的表达、纯化及其穿膜功能的鉴定
 |
| 第1页 |
参见附件(418KB，4页)。
[摘要] 目的 构建融合蛋白PTD-Calbindin D28K(OEF28)的表达质粒，并进行诱导表达、纯化，在体外初步鉴定其跨膜转运功能。方法 提取大鼠脑组织总RNA，反转录后用聚合酶链反应(PCR)法扩增编码OEln8的全长cD—NA序列，重组pET-32a及含有PID的pTransVector表达载体中，测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3)，构建重组体的表达菌株。IPTG诱导表达后，以NTA—Ni亲和层析柱进行分离纯化，SDS—PAGE以及Western blot鉴定。纯化的CaBP28及PTD-CaBP28用FITC标记，分别以一定的浓度孵育体外培养的cos7细胞，最后荧光显微镜下观察两者在细胞中的分布情况，并用流式细胞仪(FCM)做定量分析。结果 成功地构建了含有及不含有PTD的CaBP28表达载体，插入片断783 bp，表达产物相对分子质量分别约30 000、50 000，经Wetem blot鉴定，与抗CaBPD28K抗体均有特异性反应。孵育培养的cos7细胞后，CaBP28—FITC仅少量吸附于细胞膜表面，而PTD—CaBP28—FITC则分布于胞质内；FCM定量分析发现，细胞荧光强度随着目的蛋白的孵育浓度或孵育时间增加而增加，并且孵育时间为1h时荧光达到最强。结论 重组PFD-CaBP28具有良好的细胞穿膜功能。
[关键词] 蛋白质转导域； 钙结合蛋白D28K； 蛋白质治疗
[中国图书馆分类法分类号] R 743.3
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(418KB，4页)。