青心酮对缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞NF-κB、COX2表达的影响
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摘要 目的：研究青心酮对缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞NF-κB、COX2表达的影响。方法:采用人脐静脉内皮细胞ECV304细胞株，将其放入含95%N2、5%CO2混合气体的缺氧环境，制备缺氧损伤模型。实验设正常组、缺氧组、青心酮组，免疫印迹法检测IκBα、COX2蛋白的表达。结果：与正常组相比，缺氧组IκBα蛋白的表达量显著降低(P<0.01)，COX2蛋白的表达量显著升高(P<0.01)。与缺氧组相比，青心酮组IκBα蛋白的表达量显著升高(P<0.01)，COX2蛋白的表达量显著降低(P<0.01)。结论：青心酮抑制缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞NF-kB、COX2表达，可能对血管内皮细胞缺血缺氧损伤具有一定的保护作用。
关键词 青心酮 脐静脉内皮细胞 核因子κB(NF-κB) 环加氧酶2(COX2)
妊娠期高血压疾病患者全身小动脉痉挛，各组织器官因缺血缺氧受到损伤，并可引起子痫等一系列严重并发症[1]。青心酮，又名3，4-二羟基苯乙酮，是从秃毛冬青叶中提取的有效成分，临床将其用于治疗妊娠期高血压疾病取得良好疗效[2]，但其机制尚未完全阐明。本实验采用人脐静脉内皮细胞缺氧模型，观察青心酮对核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)、环加氧酶2(Cyclooxygenase-2，COX2)表达的影响，从分子水平探讨青心酮对血管缺血缺氧损伤的保护作用。
1 材料和方法
1.1 主要试剂：RPMI 1640培养基购自GIBCO公司。胎牛血清购自三利生物制品厂。BCA蛋白浓度测定试剂盒、增强化学发光试剂(ECL)购自Pierce公司。IκB、COX2多克隆抗体购自Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记的二抗由武汉凌飞科技有限公司提供。
1.2 细胞培养及实验分组：ECV304细胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI 1640培养液，于37℃、95%空气和5%CO2环境中培养，隔天换液，每4天用0.25%胰酶消化传代1次。实验当天细胞密度达到70%~80%时更换新鲜培养液，再将其分为3组：①正常组：放入含95%空气、5%CO2的培养箱内(常氧条件)；②缺氧组：放入含95%N2、5%CO2的培养箱内(缺氧条件)；③青心酮组：加入10-5mol/L DHAP，其余培养条件同缺氧组。每组设6个平行孔，培养24小时后进行各项检测。
1.3 免疫印迹法检测IκBα、COX2蛋白表达：3组细胞分别用细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取80μg总蛋白样品煮沸变性后，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后电转移至硝酸纤维素膜上，置于5%脱脂奶粉中室温封闭1h。加入1∶200稀释的一抗中4℃孵育过夜，TBSI(TBS+0.05%Tween-20)洗膜，置1∶8000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗中37℃孵育1h，TBST洗膜。将膜与ECL反应5min后，曝光于X光胶片上，显影、定影，扫描后图像分析。
1.4 统计学分析：采用SPSS13.0软件进行统计学处理，实验数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 IκBα的表达:各组IκBα蛋白表达量分别为：正常组692.68±46.18，缺氧组124.27±12.50，青心酮组257.51±27.23。与正常组相比，缺氧组IκBα蛋白的表达量显著降低(P<0.01)，而青心酮组IκBα蛋白表达较缺氧组增加(P<0.01)。
2.2 COX2蛋白的表达:各组COX2蛋白表达量分别为：正常组107.25±15.99，缺氧组429.47±37.53，青心酮组238.41±22.53。与正常组相比，缺氧组COX2蛋白的表达量显著升高(P<0.01)，而青心酮组COX2蛋白表达较缺氧组降低(P<0.01)。
3 讨论
研究已证实，缺血缺氧损伤的病理生理过程属于炎症反应[3]。NF-κB是对众多炎症介质具有转录激活功能的蛋白质[4]。在静息状态下，NF-κB以一种无活性的形式与其抑制性蛋白IκB相结合存在于胞浆中。在外界刺激下，IκB被磷酸化、泛素化并降解，NF-κB与之解离并由胞浆移位至胞核，启动一系列炎症相关基因的转录[5]。IκBα的含量与NF-κB活化情况成反比，本实验通过检测IκBα的含量来反映NF-κB活化情况。结果显示，缺氧显著促进NF-κB活化，而在青心酮联合作用下，NF-κB活化降低，提示青心酮能够抑制缺氧诱导的NF-κB活化。
环加氧酶是花生四烯酸从膜磷酸脂转化为炎性因子前列腺素类物质(如PGE2、PGI2)的关键限速酶[6]。研究发现环加氧酶有两种亚型——COXl和COX2，分别由不同的基因编码。虽然两者在结构和功能上极相似，它们在不同的组织和不同的条件下表达。COXl普遍存在，在肾、胃肠道和血小板表达最高，通常认为它生成内环境稳定必需的一种结构酶。COX2在正常生理状态下多数组织不表达，但受到细胞因子、丝裂原、细菌脂多糖等诱导时，其表达迅速上调。研究表明，COX2活化可促进血管炎症反应[7]。实验结果显示，缺氧可显著增加内皮细胞COX2的表达，而青心酮可抑制缺氧诱导的COX2表达。
既往的研究已发现[8]：青心酮具有钙拮抗作用，可扩张脐动脉；改善血液流变学特性，有效纠正病理状态下血栓素A2/前列环素失衡；增高胎盘血管壁一氧化氮合酶活性、降低血浆内皮素水平，纠正病理性一氧化氮/内皮素失衡。本研究采用人脐静脉内皮细胞缺氧模型模拟血管缺血缺氧所诱导的血管改变，结果显示青心酮可抑制缺氧诱导的NF-Kb、COX2表达，表明其可能对血管内皮细胞缺血缺氧损伤具有一定的保护作用，为深入阐明青心酮的药理作用机制提供了新的线索。
4 参考文献
[1]Cunningham FG,Hauth JC，Leveno KJ，et al.WILLIAMS OBSTETRICS•22nd Ed[M].New York：McGraw-Hill，2005:761-808.
[2]黄引平，叶笃筠 ......
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