健骨胶囊含药血清对体外培养破骨细胞活性和骨吸收作用的影响(1)
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摘 要 目的：观察健骨胶囊含药血清对体外培养新生大鼠破骨细胞活性与骨吸收的干预作用。方法：3天给药法制备健骨胶囊含药血清；机械分离培养法将新生大鼠四肢长骨干体外分离和培养破骨细胞，应用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，阳性破骨细胞计数、骨片吸收陷窝形态分析，评价健骨胶囊对破骨细胞的活性与骨吸收的作用。结果：健骨胶囊能减少体外破骨细胞的TRAP阳性细胞数及骨片吸收陷窝面积。结论：健骨胶囊含药血清对破骨细胞的活性与骨吸收具有抑制作用，为健骨胶囊治疗原发性骨质疏松症提供血清药理学依据。
关键词 健骨胶囊 原发性骨质疏松症 破骨细胞 骨吸收 血清药理学
笔者通过观察健骨胶囊含药血清对体外培养新生大鼠破骨细胞活性与骨吸收的干预作用，为健骨胶囊治疗原发性骨质疏松症提供血清药理学依据。
1 材料与方法
1.1 中药含药血清的制备：实验SD大鼠60只，雌雄各半，体重240～260g。由浙江省中医药研究院动物中心提供。实验动物合格证号：SYXK(浙)2004—0034。共分5组(空白组、健骨胶囊低剂量、中剂量、高剂量组、阳性药组)，每组12只。空白组，灌服生理盐水；健骨胶囊低剂量、中剂量、高剂量组，分别以健骨胶囊(杭州华东医药集团有限公司生产，批号051109)0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg(相当于临床成人剂量的5倍、10倍、20倍)灌胃给药；阳性药组，选用仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药股份有限公司生产，批号061038040)0.5g/kg(相当于临床成人剂量的10倍)灌胃给药。各组大鼠分别灌胃给药，给药体积为1.5ml/100g，2次/d，间隔6h，连续2天，第3天在首次给药2h后再次给药。末次给药1h后，麻醉，心脏采血。低温-4℃离心2500rmp×25min，吸取上清液。56℃水浴30min灭活，微孔滤膜过滤除菌，分装后一20℃保存备用。
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1.2 破骨细胞分离和培养(机械分离培养法)：取<24h的新生SD大鼠，蒸馏水冲洗鼠体后夹颈处死，70%乙醇浸泡2min，取四肢长骨置于冷PBS缓冲液中，用眼科剪和眼科镊分离出胫骨、股骨、肱骨、尺骨和桡骨，尽量清除骨周软组织后，即置于冷MEM分离液中，0.5～1ml MEM分离液/只(大鼠)；于分离液中用手术刀将骨质刮碎，移入10ml离心管，用圆头滴管或1ml取液枪反复吹打2min，使贴附在骨基质上的破骨细胞脱落下来，必要时可置旋涡混合器轻微混悬10sX2次，静置15～30s；取上层细胞悬液，用MEM培养液稀释到所需密度(4×104/mi)，按要求接种到盖玻片(1.8cm×1.8cm)、薄骨片(直径1.5cm，厚50μm)或培养板，贴壁培养(5%CO2，95%空气，37℃湿热)30min～1h，用预温的MEM培养液洗去未贴壁细胞(2～3次)，更换培养液继续培养，培养于含10%FBS的MEM培养液。24h后换液1次，以后1～2d换液1次。
1.3 中药含药血清培养液的配制：取中药含药血清和无血清培养液，按1:4的比例，抽滤，配制成含20%中药血清的培养液。共分5组，即空白组、健骨胶囊低剂量、中剂量、高剂量组及阳性药组。
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1.4 薄骨片的制备：取新鲜牛股骨干致密骨，用锯式切片机横切成厚50gm，直径1.5cm薄片，置蒸馏水中超声波清洗10min×3次，自然晾干，紫外线照射4～5h后，保存于4℃环境中备用。
1.5 破骨细胞的鉴定：①活体形态学鉴定：通过倒置显微镜活体观察，镜下对破骨细胞进行形态学鉴定。②抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：用MEM培养液稀释到4×104/ml，接种到盖玻片的培养皿内，待细胞生长至汇合时取出玻片，快速弃培养液，加2.5%戊二醛固定5min，浸入染色液中(染色液的配置方法如下：取六偶氮副品红溶液、亚硝酸钠溶液各0.2ml，混合30s，静置2min，加入去离子水18ml，萘酚AS-BI磷酸盐溶液0.2mI，醋酸盐溶液0.8ml，酒石酸盐溶液0.4ml配成)。37℃孵育1h后，倒置显微镜下观察并摄像。③骨吸收陷窝染色：取出骨片，用0.25%氢氧化铵超声清洗1minx 3次，系列酒精脱水(依次放入40%、70%、85%、90%酒精中浸泡，吹打)自然晾干，以1%甲苯胺蓝染色液(甲苯胺蓝、硼酸钠各1g，加三蒸水100ml溶解后过滤使用)室温染色3～4min，蒸馏水清洗后，光镜下观察并摄像。
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1.6 健骨胶囊对破骨细胞的骨吸收抑制作用药效评价：①TRAP阳性细胞数计数：骨片培养3天后，取出骨片，2.5%戊二醛固定5min，加入染色液，37℃孵育1h后倒置显微镜下观察并摄像。计数TRAP阳性多核细胞数目，结果以个/孔表示。②吸收陷窝分析：骨片培养7天后，取出骨片，2.5%戊二醛固定7min，0.25%氢氧化铵超声清洗1min×3次，系列酒精脱水(依次放入40%、70%、85%、90%酒精中浸泡，吹打)自然晾干，以1%甲苯胺蓝染色液室温染色3～4min，蒸馏水清洗后，光镜下(100×)观察并摄像，IPP形态计量软件分析吸收陷窝面积，结果以μm2/骨片表示。
2 结果
2.1 破骨细胞的鉴定：①活体观察：在倒置相差显微镜下观察容易识别，可见破骨细胞是一类多核、体积大的巨细胞，含几个至数十个核，直径大小约30～100#m，具有多粒特征，胞浆内有时可见大小不等的空泡。培养30min破骨细胞即贴壁，胞浆开始伸展，培养2小时后细胞形态清晰，呈油煎蛋形、长条形、漏斗形、不规则形等多种形态，有片状或丝状伪足，细胞形态可随培养时间延长而不断变化，详见图1。②TRAP染色反应：TRAP为破骨细胞的特异性标志酶，应用偶氮偶联组化分析法，酶活性部位显示红色反应。以萘酚二磷酸盐为底物，六偶氮副品红为显色剂，TRAP在酒石酸钾钠存在条件下，将萘酚AS-BI磷酸盐水解为萘酚AS-BI，与显色剂结合形成红色沉淀，详见图2。③骨片吸收陷窝染色：骨吸收陷窝形成是破骨细胞的特异性功能标志，有活性的破骨细胞在骨片上形成明显的吸收陷窝，基底粗糙不平、边界清晰，呈圆形或不规则形，详见图3。
2.2 健骨胶囊含药血清对大鼠破骨细胞TRAP阳性细胞数的影响：详见表1。与空白组比较，健骨胶囊低剂量、中剂量、高剂量组体外培养的破骨细胞TRAP阳性细胞数分别减少24.74%、55.80%与63.02%，具有统计学意义(P<0.01)；阳性药组减少37.63%，也有显著抑制作用(P<0.01)。
2.3 健骨胶囊含药血清对大鼠破骨细胞骨片吸收陷窝面积的影响：详见表2。与空白组比较，健骨胶囊低剂量、中剂量、高剂量组体外培养的破胃细胞骨片
共2页, 百拇医药(应栩华 陈明显 戴蕾等)