应力环境下破骨细胞碳酐酸酶Ⅱ的基因表达(2)
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5 min。对第二轮PCR产物进行2%琼脂糖电泳，检验引物设计合成无误后，进行实时荧光定量PCR，反应体系为：10×PCR缓冲液3 μL、25 mmol·L-1 MgCl2 3 μL、25 mmol·L-1 dNTPs 0.36 μL、10 μmol·L-1 CaⅡ内侧上下游引物各1 μL、10 μmol·L-1 GAPDH探针
1 μL、5 U·μL-1 Taq酶0.3 μL、ddH2O 15.34 μL、巢式PCR产物5 μL。扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s，循环45次。
将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数进行分析，绘制相应的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到阈值时的扩增循环数(Ct值)，根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数
值作图，得出该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。
根据热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度，确定Ct值，记录实验组和对照组CaⅡ和管家基因GAPDH的Ct值。假设实验组相对于对照组中CaⅡ的相对表达量为Z，并根据公式计算Z=2-△△Ct，△△Ct=(CtCaⅡ-CtGAPDH)实验组-(CtCaⅡ-CtGAPDH)对照组[7]。
1.3 统计学分析
采用SPSS 11 ......
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