重组腺病毒Ad—APN—EGFP的构建与促进种植体周围成骨(3)
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1.4 重组腺病毒Ad-APN-EGFP促进种植体周围成骨
建立大鼠股骨干骺端HA涂层种植体植入动物模型。动物给予10%水合氯醛腹腔注射行全身麻醉，行大鼠下肢膝关节内侧切口，长约1 cm，切开皮肤组织，分离皮下组织，拨开髌骨及其韧带，暴露股骨远心端关节面。用低速牙科手机和牙科钻破除手术部位皮质骨，形成种植体窝。所有动物均左腿作为实验组，右腿作为对照组。确定无明显出血后用微量加液器吸取10 μL的Ad-APN-EGFP悬浮液(左腿，实验组)或10 μL的PBS(右腿，对照组)缓慢注入窝洞内，然后将直径1.0 mm的种植钉稍稍加压放入种植窝内，骨蜡封口，分层拉拢缝合伤口，0.5%聚维酮碘喷洒伤口处。
4周后取材，去除种植钉后行石蜡包埋、切片。两组切片分别作苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，光镜下观察切片并采集图像。每组中的每个标本选择不连续的5张切片，每张切片在显微镜下围绕种植体拍摄种植体周围骨再生的照片各10张，拍摄视野为种植体周围0.5 mm范围内，用IPP 6.0软件和Spot Advance软件对照片进行测量，每张照片中的新骨总面积占该照片总视野面积的百分率作为定量依据，取均数作为定量数据。
1.5 统计分析
采用SPSS 12.0软件包对数据进行t检验，P?0.05为差异显著。
2 结果
2.1 重组腺病毒Ad-APN-EGFP鉴定结果
DNA测序结果与目标APN序列吻合。重组腺病毒Ad-APN-EGFP质粒的酶切鉴定结果和PCR鉴定结果(图1)均符合预期，证明重组腺病毒Ad-APN-EGFP构建成功。
2.2 荧光倒置显微镜下观察转染率
在转染后第1、3、5、7、14、21天转染率分别为：25%、94%、90%、83%、65%、43%。第3天转染率最高(图2)。
左：Pac Ⅰ酶切鉴定，M：Marker DL10000；1：阴性克隆；2：阳性克隆。右：PCR鉴定，M：Marker DL2000；NTC：阴性对照，无模板的PCR；1：Ad-APN-EGFP重组腺病毒质粒的PCR；2：padTrack-CMV-APN穿梭载体的PCR。
图 1 重组腺病毒Ad-APN-EGFP质粒的酶切鉴定和PCR鉴定
Fig 1 Test of Ad-APN-EGFP plasmid by restriction enzyme diges-
tion proving and PCR identification
图 2 BMSCs转染 荧光倒置显微镜 × 100
Fig 2 Transfection of BMSCs inverted fluorescence microscope × 100
2.3 Real-Time PCR检测APN表达
转染3 d的APN基因mRNA表达结果表明，B组BMSCs 的APN基因表达水平较A组明显升高(P
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