曾飒秦晓东何祥一车春晓张潇解斯羽孙贵军王立鹤

    1.兰州大学口腔医学院；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州 730000

    ·基础研究·

    慢病毒介导过表达端粒酶逆转录酶的人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

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    1.兰州大学口腔医学院；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州 730000

    目的 通过慢病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的口腔黏膜上皮细胞(OMECs)，探索构建高效、稳定的永生化OMECs细胞系的方法。方法 提取293T细胞总RNA，应用聚合酶链反应(PCR)法扩增hTERT基因全长，构建重组慢病毒载体pLVX-puro-hTERT。包装慢病毒颗粒后感染人正常OMECs，经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆，采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测hTERT基因mRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建了pLVX-puro-hTERT过表达慢病毒载体并感染到OMECs中；感染细胞与正常OMECs形态相似，呈铺路石样生长；实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示，hTERT在感染细胞中高表达，与正常细胞相比差异有统计学意义(P1 材料和方法

    1.1 材料和试剂

    慢病毒表达载体pLVX-puro、慢病毒包装质粒pMD2.G、包膜蛋白质粒psPAX2、包装细胞293T细胞株均为中国农科院兰州兽医研究所保存。Rochel逆转录试剂盒(Rochel公司，美国)，Platinum Pfx DNA Polymerase高保真DNA聚合酶和Zero Blunt TOPO聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)平端克隆试剂盒(Invitrogen公司，美国)，GeneJet PCR纯化、胶回收试剂盒(Thermo Scientific公司，美国)，质粒小量提取试剂盒(OMEGA公司，美国)，RNeasy Mini Kit试剂盒和Effectene Transfection Reagent转染试剂盒 (Qiagen公司，德国)；EpiGRO? Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit培养基、Dispase Ⅱ(Merck Millipore公司，德国)，限制性内切酶(New England Biolab公司，美国)，hTERT多克隆抗体(Proteintech公司，美国)，胎牛血清(Gibco公司 ......