抑郁症首次发病患者内皮祖细胞数量和功能变化的初步研究(2)
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1资料与方法
1.1一般资料 选取2011年2月-2013年2月到我院就诊的抑郁症患者20例作为观察组，年龄45-58岁，平均年龄49.5岁。性别为女，按照国际疾病分类第十次修订本(ICD-10)重性抑郁症的诊断标准，判断24项HAMD抑郁量表评分>35分，均为首次发作。志愿者应保证身体健康，精神状态良好，无任何头部外伤史、神经系统疾病和其他精神障碍性疾病或药物、酒精依赖者；患者与志愿者都不能有肢体缺陷，无任何磁共振扫描禁忌症；保证志愿者不能参加其他临床药物研究；保证志愿者性别与患者一致，不能处于哺乳期。选取同期与患者居住环境相同或相似的患者，要求：年龄范围一致，精神状态良好，无其他心理疾病，无酗酒吸毒现象，经过标准判断24项HAMD抑郁量表评分<8分，符合对照要求。
在开始研究之前，与志愿者及其家属说明实验方式及过程中存在的风险，并获得书面的同意证明。
1.2试验方法
1.2.1分离、培养内皮祖细胞 利用15毫升外周血分离内皮祖细胞的方法采用密度梯度离心法，密度梯度离心方法是利用成分血之间的密度差异来分开不同成分。这种方法可以得到含EPC的单个核细胞，单个核细胞包括淋巴细胞核单核细胞。用经过离心后的细胞应培养在特别的培养基中，培养基组成为胎牛血清和生长因子。第7天随机计数各组EPC集落和细胞数目，然后收集部分培养的EPC分别进行下列实验。细胞密度根据需要进行调整，接种到纤维连接蛋白包被的培养板，培养30min，在细胞贴壁状态下进行计数。将细胞密度做适当调整，利用细胞毒性试剂盒测定EPC的增殖能力。最后进行迁移方法计数，调整细胞密度24小时的培养后，用法，计算改良的Boyden小室小室下层的细胞数。
1.2.2染色、鉴定内皮祖细胞 将分离纯化后的含高密度EPC的内皮祖细胞放在无菌盖玻片，加入蛋白进行溶解，在与人体体温相同状态下进行孵育，将蛋白进行吸弃后准备使用。将分离的单个核细胞接种于放入24孔细胞培养板，每孔加入0.5ml，用盖玻片覆盖，培养箱中培养四天培养，将非贴壁细胞用PBS洗脱，换培养液至7天。在乙酞化低密度脂蛋白培养状态下继续37摄氏度孵育1h。固定细胞10min，浸洗PBS6分钟 ......
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