霍山石斛多糖对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用(1)
[摘要]目的：研究霍山石斛多糖对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用。方法：80只小鼠随机分为8组，分别为正常对照组、模型对照组、右旋糖酐对照组、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组、霍山石斛多糖高、中、低(200，100，50 mg·kg-1)剂量组，每组10只，各给药组预防给药15 d，第15天给药结束后灌胃50%(用橄榄油稀释)的CCl4 (1.5 mL·kg-1BW)，建立急性肝损伤模型，连续给药2 d，每天1次。测定小鼠血清ALT和AST及肝匀浆中 SOD，MDA含量，免疫组化法观察肝细胞中TNF-α表达水平，HE染色观察肝脏病理组织学变化。结果：霍山石斛多糖各剂量组均能降低 CCl4致小鼠急性肝损伤血清ALT，AST的升高，降低肝匀浆中MDA含量，增强SOD的活性，抑制肝细胞中TNF-α表达，减轻CCl4对肝组织的病理损伤。结论：霍山石斛多糖对CCl4致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，其保护机制可能与清除自由基，抑制脂质过氧化，抑制TNF-α表达有关。
, 百拇医药
[关键字]霍山石斛多糖；四氯化碳；急性肝损伤
霍山石斛Dendrobium huoshanense C. Z.Tang et S. J. Cheng属于兰科石斛属，主要产于安徽霍山地区，是药用石斛中的珍品，具有明目清喉、养胃清热、生津止渴、抗辐射、抗衰老等多种功效，还具有降低心率、减慢呼吸等作用[1]。现代药理研究证明，多糖是霍山石斛发挥药理活性的主要成分，具有抗氧化、治疗白内障、调节机体免疫功能、提高机体杀伤肿瘤细胞能力等活性[2]，但有关霍山石斛多糖对肝损伤的保护作用尚未见报道。本文采用CCl4致小鼠急性化学性肝损伤模型， 对霍山石斛多糖保护急性肝损伤的作用进行研究。
1材料
1.1药品与试剂霍山石斛多糖由本实验室提供，右旋糖酐T20购自都莱生物技术有限公司，淀粉购自宜兴市江山生物科技有限公司，四氯化碳购自天津市大茂化学试剂厂，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠TNF-α一抗、羊抗兔IgG-FITC二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯。
, 百拇医药
1.2动物SPF级♂昆明种小鼠，体重(20±2) g，购自安徽医科大学动物实验中心，合格证号SCXK(皖)2011-002。
1.3仪器V1100型可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；7890A/5975C型气质联用分析仪(安捷伦科技有限公司)；Nicolet 67傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司)。
2方法
2.1霍山石斛多糖的制备取1 kg霍山石斛鲜材料，按照1∶3的料液比，在70 ℃条件下搅拌浸提2 h后离心，得上清液，重复提取2次，合并2次所得上清液，用80%的乙醇沉淀24 h，离心取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，采用Sevag法脱蛋白，透析(MWCO：3 000 Da)24 h，然后减压浓缩至膏状，冷冻干燥得霍山石斛粗多糖，平均提取率为4.35%。
2.2理化性质的测定
, 百拇医药
2.2.1水分和灰分的测定100 ℃下常压烘干，称量，测定霍山石斛多糖的水分含量；采用马弗炉灼烧法测定灰分含量。
2.2.2碳水化合物含量的测定取适量多糖水溶液，以葡萄糖为标准品，按蒽酮-硫酸法比色测定总糖含量。
2.2.3可溶性蛋白含量的测定取适量多糖水溶液，以牛血清蛋白为标准品，按考马斯亮蓝法比色测定蛋白含量。
2.2.4糖醛酸含量的测定[3]取0.1 g·L-1的霍山石斛多糖样品溶液0.15 mL，加蒸馏水至0.25 mL。在冰浴中加入1.5 mL四硼酸钠硫酸试液，混匀，沸水浴加热5 min，迅速冷却至室温，加25 μL间羟联苯试液，摇匀，测定520 nm处吸光值，绘制标准曲线并根据标准曲线计算样品中糖醛酸含量。
2.2.5单糖组成分析[4]取5 mg霍山石斛多糖样品，溶解于4 mL 2 mol·L-1的三氟乙酸中，置于10 mL安培管中，酒精喷灯封管，120 ℃水解4 h，减压蒸干，加3 mL甲醇继续蒸干，重复加甲醇4～5次，除尽残留的三氟乙酸。将完全水解的霍山石斛多糖样品溶解于3 mL蒸馏水中，加30 mg硼氢化钠，室温还原3 h，用25%的醋酸中和过量的硼氢化钠，到溶液不再产生气泡为止，减压蒸干，加3 mL甲醇蒸干，重复加甲醇4～5次除去硼酸及水分，在50 ℃真空干燥箱中干燥5 h，120 ℃烘箱15 min充分除去水分，加3 mL乙酸酐和3 mL吡啶，密塞，100 ℃反应1 h，减压蒸干后用三氯甲烷萃取，进行GC-MS分析。
, 百拇医药
2.2.6红外光谱分析取一定量样品与溴化钾研磨均匀压片，在4 000～400 cm -1扫描霍山石斛多糖。
2.3霍山石斛多糖对肝损伤的影响
2.3.1动物分组及给药将小鼠随机分为8组，每组10只，分别为：正常对照组、模型对照组、右旋糖酐对照组、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组、霍山石斛多糖高、中、低(200，100，50 mg·kg -1，折合为霍山石斛干材料分别为4.60，2.30，1.15 g·kg -1 )剂量组，各给药组预防给药15 d，第15 天给药结束后灌胃50%(用橄榄油稀释)的CCl4(1.5 mL·kg -1BW)，建立急性肝损伤模型，连续给药2 d，每天1次。末次给药后禁食，16 h 后心脏取血，并分离小鼠肝脏，检测各项生化指标。, 百拇医药(黄静 李胜立 赵宏伟 潘利华 孙撬撬 罗建平)
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[关键字]霍山石斛多糖；四氯化碳；急性肝损伤
霍山石斛Dendrobium huoshanense C. Z.Tang et S. J. Cheng属于兰科石斛属，主要产于安徽霍山地区，是药用石斛中的珍品，具有明目清喉、养胃清热、生津止渴、抗辐射、抗衰老等多种功效，还具有降低心率、减慢呼吸等作用[1]。现代药理研究证明，多糖是霍山石斛发挥药理活性的主要成分，具有抗氧化、治疗白内障、调节机体免疫功能、提高机体杀伤肿瘤细胞能力等活性[2]，但有关霍山石斛多糖对肝损伤的保护作用尚未见报道。本文采用CCl4致小鼠急性化学性肝损伤模型， 对霍山石斛多糖保护急性肝损伤的作用进行研究。
1材料
1.1药品与试剂霍山石斛多糖由本实验室提供，右旋糖酐T20购自都莱生物技术有限公司，淀粉购自宜兴市江山生物科技有限公司，四氯化碳购自天津市大茂化学试剂厂，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠TNF-α一抗、羊抗兔IgG-FITC二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯。
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1.2动物SPF级♂昆明种小鼠，体重(20±2) g，购自安徽医科大学动物实验中心，合格证号SCXK(皖)2011-002。
1.3仪器V1100型可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；7890A/5975C型气质联用分析仪(安捷伦科技有限公司)；Nicolet 67傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司)。
2方法
2.1霍山石斛多糖的制备取1 kg霍山石斛鲜材料，按照1∶3的料液比，在70 ℃条件下搅拌浸提2 h后离心，得上清液，重复提取2次，合并2次所得上清液，用80%的乙醇沉淀24 h，离心取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，采用Sevag法脱蛋白，透析(MWCO：3 000 Da)24 h，然后减压浓缩至膏状，冷冻干燥得霍山石斛粗多糖，平均提取率为4.35%。
2.2理化性质的测定
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2.2.1水分和灰分的测定100 ℃下常压烘干，称量，测定霍山石斛多糖的水分含量；采用马弗炉灼烧法测定灰分含量。
2.2.2碳水化合物含量的测定取适量多糖水溶液，以葡萄糖为标准品，按蒽酮-硫酸法比色测定总糖含量。
2.2.3可溶性蛋白含量的测定取适量多糖水溶液，以牛血清蛋白为标准品，按考马斯亮蓝法比色测定蛋白含量。
2.2.4糖醛酸含量的测定[3]取0.1 g·L-1的霍山石斛多糖样品溶液0.15 mL，加蒸馏水至0.25 mL。在冰浴中加入1.5 mL四硼酸钠硫酸试液，混匀，沸水浴加热5 min，迅速冷却至室温，加25 μL间羟联苯试液，摇匀，测定520 nm处吸光值，绘制标准曲线并根据标准曲线计算样品中糖醛酸含量。
2.2.5单糖组成分析[4]取5 mg霍山石斛多糖样品，溶解于4 mL 2 mol·L-1的三氟乙酸中，置于10 mL安培管中，酒精喷灯封管，120 ℃水解4 h，减压蒸干，加3 mL甲醇继续蒸干，重复加甲醇4～5次，除尽残留的三氟乙酸。将完全水解的霍山石斛多糖样品溶解于3 mL蒸馏水中，加30 mg硼氢化钠，室温还原3 h，用25%的醋酸中和过量的硼氢化钠，到溶液不再产生气泡为止，减压蒸干，加3 mL甲醇蒸干，重复加甲醇4～5次除去硼酸及水分，在50 ℃真空干燥箱中干燥5 h，120 ℃烘箱15 min充分除去水分，加3 mL乙酸酐和3 mL吡啶，密塞，100 ℃反应1 h，减压蒸干后用三氯甲烷萃取，进行GC-MS分析。
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2.2.6红外光谱分析取一定量样品与溴化钾研磨均匀压片，在4 000～400 cm -1扫描霍山石斛多糖。
2.3霍山石斛多糖对肝损伤的影响
2.3.1动物分组及给药将小鼠随机分为8组，每组10只，分别为：正常对照组、模型对照组、右旋糖酐对照组、淀粉对照组、多糖全水解产物对照组、霍山石斛多糖高、中、低(200，100，50 mg·kg -1，折合为霍山石斛干材料分别为4.60，2.30，1.15 g·kg -1 )剂量组，各给药组预防给药15 d，第15 天给药结束后灌胃50%(用橄榄油稀释)的CCl4(1.5 mL·kg -1BW)，建立急性肝损伤模型，连续给药2 d，每天1次。末次给药后禁食，16 h 后心脏取血，并分离小鼠肝脏，检测各项生化指标。, 百拇医药(黄静 李胜立 赵宏伟 潘利华 孙撬撬 罗建平)