马钱子总生物碱复合磷脂脂质体的制备与温敏释放性质研究(1)
[摘要] 以氢化大豆磷脂(HSPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)为复合磷脂，制备了马钱子总生物碱复合磷脂脂质体，并与常规的DPPC温敏脂质体比较温敏释放性质。采用浸渍法提取马钱子总生物碱并进行了纯化。采用硫酸铵梯度法和隐形脂质体技术制备了马钱子总生物碱复合磷脂脂质体、温敏脂质体、不具备温敏释放性质的常规脂质体，比较了三者的包封率、粒径、电位、温敏释放行为。3种脂质体的包封率相当，复合磷脂脂质体与温敏脂质体的粒径明显小于常规脂质体，但载体的表面电位没有差别。比较了3种脂质体在37，43 ℃下释放行为的差别，结果表明，马钱子总生物碱复合磷脂脂质体在37 ℃的释放明显低于温敏脂质体，而在43 ℃的释放度高于温敏脂质体，常规脂质体由于相变温度很高，在这2种温度下都几乎不释放。该文的研究结果表明在溶血磷脂用量减少2.5倍的情况下，复合磷脂脂质体具有更好的温敏释放行为。
[关键词] 马钱子；总生物碱；隐形脂质体；温敏释放；氢化大豆磷脂；二棕榈酰磷脂酰胆碱
[稿件编号] 20121206019
, http://www.100md.com
[基金项目] 江苏高校优势学科建设工程项目[PAPD(ysxk2010)]；江苏省大学生实践创新训练计划重点项目(2012JSSPITP1071)；南京中医药大学中药学一级学科开放课题项目(2011ZYX3003)
[通信作者] *陈军，副教授，主要从事中药新型给药系统与药动学研究，Tel：(025)85811050， Email：chenjun75@163.com；*蔡宝昌，教授，主要从事中药炮制学研究，Tel：(025)85811112，Email：bccai@126.com
脂质体(liposomes)是一种结构和组成均类似于生物膜双分子层的微型囊泡，具有靶向、缓释、生物相容性等特点，是抗肿瘤药物常用的靶向载体。近年来的研究表明，脂质体由于粒径相对较大，通过高通透性和滞留效应(enhanced permeation and retention，EPR)分布进入肿瘤部位以后，脂质体集中分布在血管周围区域(脂质体只能扩散到血管大概10 μm以内，而游离药物可以扩散到100～200 μm[1])，不易扩散进入癌组织深处与癌细胞充分作用，这就使得靶向脂质体在治疗体积较大的肿瘤(例如肝癌)时往往不能充分发挥作用。
, http://www.100md.com
温敏脂质体(thermosensitive liposomes，TSL)的出现克服了这一问题[2]。TSL分布进入被加热的肿瘤部位后，当温度达到相变温度后能够迅速释放药物发挥作用。由于相变温度在42 ℃左右，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)被广泛用于TSL的制备，为了保证具有足够的温敏释放特性，目前普遍的做法是在DPPC中添加10%的溶血磷脂(如MSPC)，当温度达到相变温度时，溶血磷脂能够在脂质双分子层膜上形成孔隙，有利于药物的释放[3]。但是，溶血磷脂不但价格昂贵而且静脉注射后存在安全隐患。本文在前期研究的基础上[4]，尝试采用复合磷脂技术，对经典温敏脂质体的处方进行优化，以期在保证良好的温敏释放性能前提下，减少溶血磷脂的用量。
马钱子总生物碱是中药马钱子公认的活性部位，本实验室的前期研究表明其具有显著的抗肿瘤特性[5]，但毒性较强，采用靶向脂质体作为载体可以显著地降低马钱子生物碱的毒性，提高其抗肿瘤效果[6]，因此本文选择马钱子总生物碱为模型药物，探讨制备中药TSL的可行性。
, http://www.100md.com
1 材料
1.1 仪器
LC20A高效液相色谱仪(日本岛津)；UV2800AH紫外可见分光光度计(上海尤尼柯有限公司)；TP5智能透皮扩散仪(南京新联电子有限公司)；SHZD(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；DZF6050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；KH100B超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；TK12B透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司)；JY92Ⅱ超声细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BS124S电子天平(德国赛多利斯公司)；HL2S恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司)；Zeta Potential Analyzer(美国Brookhaven Instruments Corporation)。
1.2 药品与试剂
氢化大豆磷脂(HSPC，德国Lipoid公司，批号2562251)；二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC，德国Lipoid公司，批号5631071)；二硬脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPEPEG2000，上海艾韦特医药科技有限公司，批号B10206)；溶血磷脂MSPC(上海艾韦特医药科技有限公司，批号RJAXL121)；制马钱子(浙江中医药大学饮片厂)；士的宁(纯度>99%)、马钱子碱对照品(纯度98%)均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为090307，110706；Sephadex G50(Pharmacia公司)；其他试剂均为分析纯。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 马钱子总生物碱的制备
2.1.1 提取与纯化[5] 取制马钱子品粉末(过20目筛，45 ℃干燥6 h)约50 g，精密称重，加15倍量70%乙醇，回流提取3次，每次0.5 h，过滤，合并3次滤液，真空浓缩至干，精密称重。用1 mol·L-1盐酸100 mL超声溶解，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用40%NaOH调节pH 12.0，用二氯甲烷萃取3次，合并，浓缩后真空干燥，精密称重，即得马钱子总生物碱，平均得率(2.63±1.30)%(n=10)。
2.1.2 成分分析 取总生物碱提取物， 用氯仿溶解配成1 g·L-1的溶液， 精密吸取2 mL， 用甲醇定容至10 mL，摇匀，以2010年版《中国药典》一部规定的方法[7]，采用HPLC测定马钱子碱和士的宁的含量。结果表明，在总生物碱提取物中，士的宁占(37.59±0.91)%，马钱子碱占(26. 51±1.50)%(n=10)。, 百拇医药(何超芹，胡梦雅，张会，常昊，陈军，蔡宝昌)
[关键词] 马钱子；总生物碱；隐形脂质体；温敏释放；氢化大豆磷脂；二棕榈酰磷脂酰胆碱
[稿件编号] 20121206019
, http://www.100md.com
[基金项目] 江苏高校优势学科建设工程项目[PAPD(ysxk2010)]；江苏省大学生实践创新训练计划重点项目(2012JSSPITP1071)；南京中医药大学中药学一级学科开放课题项目(2011ZYX3003)
[通信作者] *陈军，副教授，主要从事中药新型给药系统与药动学研究，Tel：(025)85811050， Email：chenjun75@163.com；*蔡宝昌，教授，主要从事中药炮制学研究，Tel：(025)85811112，Email：bccai@126.com
脂质体(liposomes)是一种结构和组成均类似于生物膜双分子层的微型囊泡，具有靶向、缓释、生物相容性等特点，是抗肿瘤药物常用的靶向载体。近年来的研究表明，脂质体由于粒径相对较大，通过高通透性和滞留效应(enhanced permeation and retention，EPR)分布进入肿瘤部位以后，脂质体集中分布在血管周围区域(脂质体只能扩散到血管大概10 μm以内，而游离药物可以扩散到100～200 μm[1])，不易扩散进入癌组织深处与癌细胞充分作用，这就使得靶向脂质体在治疗体积较大的肿瘤(例如肝癌)时往往不能充分发挥作用。
, http://www.100md.com
温敏脂质体(thermosensitive liposomes，TSL)的出现克服了这一问题[2]。TSL分布进入被加热的肿瘤部位后，当温度达到相变温度后能够迅速释放药物发挥作用。由于相变温度在42 ℃左右，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)被广泛用于TSL的制备，为了保证具有足够的温敏释放特性，目前普遍的做法是在DPPC中添加10%的溶血磷脂(如MSPC)，当温度达到相变温度时，溶血磷脂能够在脂质双分子层膜上形成孔隙，有利于药物的释放[3]。但是，溶血磷脂不但价格昂贵而且静脉注射后存在安全隐患。本文在前期研究的基础上[4]，尝试采用复合磷脂技术，对经典温敏脂质体的处方进行优化，以期在保证良好的温敏释放性能前提下，减少溶血磷脂的用量。
马钱子总生物碱是中药马钱子公认的活性部位，本实验室的前期研究表明其具有显著的抗肿瘤特性[5]，但毒性较强，采用靶向脂质体作为载体可以显著地降低马钱子生物碱的毒性，提高其抗肿瘤效果[6]，因此本文选择马钱子总生物碱为模型药物，探讨制备中药TSL的可行性。
, http://www.100md.com
1 材料
1.1 仪器
LC20A高效液相色谱仪(日本岛津)；UV2800AH紫外可见分光光度计(上海尤尼柯有限公司)；TP5智能透皮扩散仪(南京新联电子有限公司)；SHZD(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；DZF6050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；KH100B超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；TK12B透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司)；JY92Ⅱ超声细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BS124S电子天平(德国赛多利斯公司)；HL2S恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司)；Zeta Potential Analyzer(美国Brookhaven Instruments Corporation)。
1.2 药品与试剂
氢化大豆磷脂(HSPC，德国Lipoid公司，批号2562251)；二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC，德国Lipoid公司，批号5631071)；二硬脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPEPEG2000，上海艾韦特医药科技有限公司，批号B10206)；溶血磷脂MSPC(上海艾韦特医药科技有限公司，批号RJAXL121)；制马钱子(浙江中医药大学饮片厂)；士的宁(纯度>99%)、马钱子碱对照品(纯度98%)均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为090307，110706；Sephadex G50(Pharmacia公司)；其他试剂均为分析纯。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 马钱子总生物碱的制备
2.1.1 提取与纯化[5] 取制马钱子品粉末(过20目筛，45 ℃干燥6 h)约50 g，精密称重，加15倍量70%乙醇，回流提取3次，每次0.5 h，过滤，合并3次滤液，真空浓缩至干，精密称重。用1 mol·L-1盐酸100 mL超声溶解，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用40%NaOH调节pH 12.0，用二氯甲烷萃取3次，合并，浓缩后真空干燥，精密称重，即得马钱子总生物碱，平均得率(2.63±1.30)%(n=10)。
2.1.2 成分分析 取总生物碱提取物， 用氯仿溶解配成1 g·L-1的溶液， 精密吸取2 mL， 用甲醇定容至10 mL，摇匀，以2010年版《中国药典》一部规定的方法[7]，采用HPLC测定马钱子碱和士的宁的含量。结果表明，在总生物碱提取物中，士的宁占(37.59±0.91)%，马钱子碱占(26. 51±1.50)%(n=10)。, 百拇医药(何超芹，胡梦雅，张会，常昊，陈军，蔡宝昌)