三七总皂苷对大鼠肝脏药物代谢酶酶活性、mRNA及蛋白表达的影响(1)
[摘要]研究三七总皂苷对大鼠肝脏药物代谢酶酶活性、mRNA及蛋白表达的影响。将Wistar雄性大鼠随机分为9组，给予受试药后，提取肝脏微粒体，肝脏总RNA和总蛋白，分别采用底物探针法、荧光定量PCR技术和Western blot，检测三七总皂苷对肝脏药物代谢酶相关亚型酶活性、mRNA和蛋白质表达3个水平的调节作用。实验的结果是三七总皂苷能显著诱导CYP1A2和CYP2E1酶活性和mRNA表达，同时对CYP2E1的蛋白表达水平也有显著诱导作用；三七总皂苷显著诱导CYP3A mRNA表达，但对CYP3A酶活性水平无明显的影响；三七总皂苷对CYP1A1和CYP2B mRNA表达和酶活性均无明显影响。三七总皂苷对不同的P450亚型的调节作用具有选择性，主要的调节亚型是CYP1A2和CYP2E1，临床应用时，尤其是与CYP1A2和CYP2E1代谢有关药物合用时，应充分考虑到可能产生的药物相互作用以避免潜在的不良反应和毒副作用，同时对CYP2E1的诱导作用是否与人参皂苷清除自由基作用有关值得进一步研究。
[关键词]三七总皂苷；细胞色素P450；荧光定量PCR技术
, 百拇医药
由五加科植物三七根中有效成分三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，简称PNS)提取物制成的血栓通注射液、注射用粉针血塞通，已广泛应用于临床治疗瘀血阻络、脑血管疾病后遗症、视网膜中央静脉阻塞等疾病[1-2]，与其他药物联合使用也较为常见，如与纳洛酮等药物联合使用用于脑梗死急救[3]。目前，有关中药注射剂安全性的问题报道日益增多，由药物诱导或抑制细胞色素P450导致的药物间的相互作用日益受到关注，但是有关中药复方及中药复方对CYP450的影响作用的系统研究尚未展开，有关PNS对细胞色素P450的影响的研究还不够全面，本实验将从酶活性水平、mRNA表达和蛋白质表达3个水平研究PNS对P450的多个亚型影响，为完善该药的代谢性相互作用和指导临床合理用药奠定基础。
1 材料
1.1 药品与试剂 三七总皂苷，广西梧州制药股份有限公司，散包，依据国家药品标准WS-10460-(ZD-0460)-2002-2011Z检验合格，生产批号120801；3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene，3MET)；β-萘黄酮(β-naphthoflavone，β-NAP)；苯巴比妥(phenobarbital，PB)；地塞米松(dexamethasone，DEX)；甲氧基异酚恶唑；乙氧基异酚恶唑；戊氧基异酚恶唑；对硝基苯酚；其他试剂均为国产分析纯。
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1.2 仪器 J-301超高速离心机(Avanti 公司)；荧光定量PCR仪(AB公司，Real-time PCR system，型号272006169)；Victorx 5酶标仪(Perkin Elmer 2030 Multilabel Reader)；HH·SY11-Ni水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；BS223S电子天平(Sartorius公司)；MHD10D003离心机(BeckMAN公司)。
1.3 动物 Wistar雄性大鼠，体重180～220 g，由军事医学科学院动物实验中心提供，许可证号SCXK(军)2012-0004。
2 方法
2.1 给药方法 大鼠随机分为9组，每组8只，第1～5组为5个阳性对照组；第1组是大鼠肝脏CYP1A1的阳性诱导药3-甲基胆蒽组，腹腔注射3-甲基胆蒽50 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续3 d；第2组是CYP1A2的阳性诱导药β-萘黄酮组，腹腔注射β-萘黄酮40 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续7 d；第3组是CYP2B的阳性诱导药苯巴比妥组，腹腔注射苯巴比妥50 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续3 d；第4组是CYP2E1的阳性诱导药乙醇组，腹腔注射35%乙醇1 250 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续7 d；第5组是CYP3A的阳性诱导药地塞米松组，腹腔注射地塞米松 37.5 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续7 d。第6～8组为给药组，分别为PNS低、中、高剂量组，给药剂量分别25，37.5，50 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，给药时间均为14 d。第9组是空白组。
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2.2 底物探针法测定PNS对大鼠肝脏P450酶活性水平的影响 肝微粒体制备及蛋白含量测定：各组大鼠给药结束后，禁食12 h，麻醉后，脱臼处死，迅速剪开心脏，用注射器以4 ℃生理盐水由门静脉灌洗，结扎上腔静脉，灌洗至肝脏呈土黄色。将肝脏剪碎，按1∶4加入TMS缓冲液，冰浴中匀浆。匀浆液4 ℃，12 000×g离心20 min，弃沉淀。上清液4 ℃，105 000×g离心60 min，弃上清，沉淀部分即微粒体。按初始匀浆时每克肝组织加入1 mL Tris-HCl储存液(4 ℃)， 重悬微粒体，冰浴，玻璃匀浆管手动研磨，使微粒体均匀分散。分装微粒体。-80 ℃保存。使用博迈德公司的BCA试剂盒测定肝微粒体蛋白含量，按试剂盒说明书进行操作。
测定PNS对肝脏CYP1A1，CYP1A2和CYP2B酶活性的影响：参照EROD酶活性测定方法[4]，并做了部分改动。将底物与1 mg肝微粒体混合，加入Tris-HCl(pH 7.8)至终体积为1 mL，加入NADPH(1 mmol·L-1)，在37 ℃环境中启动反应，产物为试卤灵，反应持续30 min，加入适量乙腈终止反应，离心去除沉淀。在激发光为530 nm，发射光为585 nm的条件下，测定其吸光度。各亚型的底物及浓度依次为乙氧基异酚恶唑(30 μmol·L-1)、甲氧基异酚恶唑(15 μmol·L-1)和戊氧基异酚恶唑(30 μmol·L-1)。, http://www.100md.com(陈艳进 王宇光 马增春 肖成荣 谭洪玲 梁乾德 汤响林 赵永红 王东根 高月)
[关键词]三七总皂苷；细胞色素P450；荧光定量PCR技术
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由五加科植物三七根中有效成分三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，简称PNS)提取物制成的血栓通注射液、注射用粉针血塞通，已广泛应用于临床治疗瘀血阻络、脑血管疾病后遗症、视网膜中央静脉阻塞等疾病[1-2]，与其他药物联合使用也较为常见，如与纳洛酮等药物联合使用用于脑梗死急救[3]。目前，有关中药注射剂安全性的问题报道日益增多，由药物诱导或抑制细胞色素P450导致的药物间的相互作用日益受到关注，但是有关中药复方及中药复方对CYP450的影响作用的系统研究尚未展开，有关PNS对细胞色素P450的影响的研究还不够全面，本实验将从酶活性水平、mRNA表达和蛋白质表达3个水平研究PNS对P450的多个亚型影响，为完善该药的代谢性相互作用和指导临床合理用药奠定基础。
1 材料
1.1 药品与试剂 三七总皂苷，广西梧州制药股份有限公司，散包，依据国家药品标准WS-10460-(ZD-0460)-2002-2011Z检验合格，生产批号120801；3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene，3MET)；β-萘黄酮(β-naphthoflavone，β-NAP)；苯巴比妥(phenobarbital，PB)；地塞米松(dexamethasone，DEX)；甲氧基异酚恶唑；乙氧基异酚恶唑；戊氧基异酚恶唑；对硝基苯酚；其他试剂均为国产分析纯。
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1.2 仪器 J-301超高速离心机(Avanti 公司)；荧光定量PCR仪(AB公司，Real-time PCR system，型号272006169)；Victorx 5酶标仪(Perkin Elmer 2030 Multilabel Reader)；HH·SY11-Ni水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；BS223S电子天平(Sartorius公司)；MHD10D003离心机(BeckMAN公司)。
1.3 动物 Wistar雄性大鼠，体重180～220 g，由军事医学科学院动物实验中心提供，许可证号SCXK(军)2012-0004。
2 方法
2.1 给药方法 大鼠随机分为9组，每组8只，第1～5组为5个阳性对照组；第1组是大鼠肝脏CYP1A1的阳性诱导药3-甲基胆蒽组，腹腔注射3-甲基胆蒽50 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续3 d；第2组是CYP1A2的阳性诱导药β-萘黄酮组，腹腔注射β-萘黄酮40 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续7 d；第3组是CYP2B的阳性诱导药苯巴比妥组，腹腔注射苯巴比妥50 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续3 d；第4组是CYP2E1的阳性诱导药乙醇组，腹腔注射35%乙醇1 250 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续7 d；第5组是CYP3A的阳性诱导药地塞米松组，腹腔注射地塞米松 37.5 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，连续7 d。第6～8组为给药组，分别为PNS低、中、高剂量组，给药剂量分别25，37.5，50 mg·kg-1·d-1，每日给药1次，给药时间均为14 d。第9组是空白组。
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2.2 底物探针法测定PNS对大鼠肝脏P450酶活性水平的影响 肝微粒体制备及蛋白含量测定：各组大鼠给药结束后，禁食12 h，麻醉后，脱臼处死，迅速剪开心脏，用注射器以4 ℃生理盐水由门静脉灌洗，结扎上腔静脉，灌洗至肝脏呈土黄色。将肝脏剪碎，按1∶4加入TMS缓冲液，冰浴中匀浆。匀浆液4 ℃，12 000×g离心20 min，弃沉淀。上清液4 ℃，105 000×g离心60 min，弃上清，沉淀部分即微粒体。按初始匀浆时每克肝组织加入1 mL Tris-HCl储存液(4 ℃)， 重悬微粒体，冰浴，玻璃匀浆管手动研磨，使微粒体均匀分散。分装微粒体。-80 ℃保存。使用博迈德公司的BCA试剂盒测定肝微粒体蛋白含量，按试剂盒说明书进行操作。
测定PNS对肝脏CYP1A1，CYP1A2和CYP2B酶活性的影响：参照EROD酶活性测定方法[4]，并做了部分改动。将底物与1 mg肝微粒体混合，加入Tris-HCl(pH 7.8)至终体积为1 mL，加入NADPH(1 mmol·L-1)，在37 ℃环境中启动反应，产物为试卤灵，反应持续30 min，加入适量乙腈终止反应，离心去除沉淀。在激发光为530 nm，发射光为585 nm的条件下，测定其吸光度。各亚型的底物及浓度依次为乙氧基异酚恶唑(30 μmol·L-1)、甲氧基异酚恶唑(15 μmol·L-1)和戊氧基异酚恶唑(30 μmol·L-1)。, http://www.100md.com(陈艳进 王宇光 马增春 肖成荣 谭洪玲 梁乾德 汤响林 赵永红 王东根 高月)