基于ITS序列鉴别石斛类药材(1)
[摘要]获得高质量的DNA是中药石斛分子鉴别的关键所在。研究比较DNA提取方法(试剂盒提取、CTAB法)，从石斛类药材中提取可用于PCR扩增的基因组DNA，基于ITS序列分析进行药材基原鉴别。结果表明，采用改良CTAB法(大量提取)，从22批石斛类药材中富集并提取到基因组DNA，通过克隆测序获得ITS序列，同研究积累的石斛属植物ITS序列资料与Genbank序列数据库进行比对分析，根据序列相似性程度从12批黄草药材中鉴定石斛14种，近似种5种；从10批枫斗中鉴定石斛6种，近似种3种。该方法弥补了传统生药学鉴定方法在石斛类药材鉴别上的局限性，具有一定的应用前景。
[关键词]石斛；DNA提取；分子鉴别
石斛类药材为我国名贵传统中药材，药用历史悠久，历版中国药典对来源都有明确记载。2010年版《中国药典》记载为兰科石斛属金钗石斛Dendrobium nobile、鼓槌石斛D. chrysotoxum或流苏石斛D. fimbriatum的栽培品及其同源近似种的新鲜或干燥茎[1]；另将铁皮石斛单列，记载铁皮石斛为石斛属铁皮石斛D. officinale干燥茎，加工成螺旋形或弹簧状的习称“铁皮枫斗”(耳环石斛)，切成段的习称“铁皮石斛” [1]。石斛药材来源多年依赖于野生资源，资源紧缺，药用品种混乱，一批药材中常混有石斛属数种甚至10多种。自20世纪80年代以来，据文献记载以及本课题组对石斛商品的市场调查，在我国分布的石斛属74种2变种中[2]，先后有近50种做中药石斛药用。其中很多种类在有叶无花或无花无叶的新鲜状态下(鲜品入药)就难以鉴别，直接加工干燥的“黄草”、切段干燥的“黄草饮片”，或者边加热边加工的螺旋状“枫斗”形态更加相似，仅依靠外部特征鉴定其基原具有很大的难度，因此，石斛成为公认的鉴定最困难的一类中药材，历来有医工难辨之称[3]。
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近年来，DNA分子标记技术在石斛属植物的鉴定方面取得很多研究进展，但这些研究多以新鲜、冰冻或硅胶快速干燥，已鉴定学名的材料为对象，研究比较不同的DNA分子标记在石斛属植物中的分辨率及鉴定价值[4-15]，而将分子标记应用于品种混乱的干药材鉴别还鲜有报道。干燥石斛药材不同于新鲜材料，在干燥、加工、贮藏等过程均造成了DNA不同程度降解，同时药材中丰富的多糖、蛋白质及多酚类等成分都影响后续PCR扩增、酶切等相关研究，因此需要探索适合于石斛类药材的DNA提取分离方法，获得高质量的DNA，然后选取合适的DNA标记进行鉴定研究。
位于核基因组的rDNA ITS区因进化速率快，分辨率高，是植物条形码鉴别的重要候选基因片段。研究表明ITS序列在石斛属种间具有较大的变异，而在种内具有一定的遗传稳定性，是石斛物种鉴别的有效DNA分子标记[4，6-7，12，14]，而有关该片段直接用于石斛药材鉴定尚未见报道。本文基于本课题组积累与Genbank收载的石斛属植物ITS序列资料，在研究药材DNA提取方法基础上，从药材中扩增ITS序列，通过克隆测序获得药材序列，经过与同源序列比对分析，对石斛类药材的基原进行鉴别。
, 百拇医药
1 材料
实验用石斛药材共计22批，包括12批切段的黄草，10批枫斗，分别购自于安徽、河北、广州、上海、浙江等地，现保存于上海中医药大学中药研究所，来源见表1。样品用蒸馏水与70%乙醇清洗表面，切成小碎块或者直接打粉备用。
2 方法
2.1 基因组DNA的提取 取石斛类药材干燥茎，将表面用无菌水冲洗干净，切成小碎块或者直接打粉，在液氮中进一步研磨成细粉，分别采用改良CTAB法(干药材约50 mg微量提取；干药材约500 mg大量提取)与试剂盒探索药材总DNA提取方法。
试剂盒提取：取干燥药材，加液氮碾磨成细分，取20 mg，根据QIAGEN试剂盒使用指南进行总DNA提取。
改良CTAB法提取：对经典CTAB方法进行改进，提高提取液中CTAB的浓度(由2%提高至3%)；将经典的氯仿萃取去除蛋白方法改进为苯酚-氯仿-异戊醇与氯仿-异戊醇结合使用去除蛋白。
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干燥药材切块或粉碎，加液氮碾磨成细粉，取约50 mg (微量提取)或500 mg(大量提取)细粉，迅速转移至离心管中，加入已65 ℃预热的CTAB提取液(3% CTAB；100 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0；1.4 mol·L-1 NaCl )，混匀。65 ℃保温2～4 h (期间多次轻轻颠倒混匀，使DNA提取充分 )，取出，冷却至室温，12 000 r·min-1室温离心10 min，吸取上清液，用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇 (25∶24∶1)萃取1次，吸取上清液；在上清液中加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1) 萃取液，上下多次颠倒，至萃取充分，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min；吸取上清液，加入氯仿-异戊醇(24∶1)重复萃取数次至两相间无沉淀物。吸取上清液加入1/10体积的3 mmol·L-1 NaAc与2～2.5倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，混匀，-20 ℃放置1～2 h，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min ，弃液，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次(4 ℃，5 000 r·min-1，离心5 min)，弃液，晾干，加入TE液 (10 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0) 溶解，-20 ℃保存备用。, http://www.100md.com(叶子 卢叶 王峥涛 徐红 胡之璧)
[关键词]石斛；DNA提取；分子鉴别
石斛类药材为我国名贵传统中药材，药用历史悠久，历版中国药典对来源都有明确记载。2010年版《中国药典》记载为兰科石斛属金钗石斛Dendrobium nobile、鼓槌石斛D. chrysotoxum或流苏石斛D. fimbriatum的栽培品及其同源近似种的新鲜或干燥茎[1]；另将铁皮石斛单列，记载铁皮石斛为石斛属铁皮石斛D. officinale干燥茎，加工成螺旋形或弹簧状的习称“铁皮枫斗”(耳环石斛)，切成段的习称“铁皮石斛” [1]。石斛药材来源多年依赖于野生资源，资源紧缺，药用品种混乱，一批药材中常混有石斛属数种甚至10多种。自20世纪80年代以来，据文献记载以及本课题组对石斛商品的市场调查，在我国分布的石斛属74种2变种中[2]，先后有近50种做中药石斛药用。其中很多种类在有叶无花或无花无叶的新鲜状态下(鲜品入药)就难以鉴别，直接加工干燥的“黄草”、切段干燥的“黄草饮片”，或者边加热边加工的螺旋状“枫斗”形态更加相似，仅依靠外部特征鉴定其基原具有很大的难度，因此，石斛成为公认的鉴定最困难的一类中药材，历来有医工难辨之称[3]。
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近年来，DNA分子标记技术在石斛属植物的鉴定方面取得很多研究进展，但这些研究多以新鲜、冰冻或硅胶快速干燥，已鉴定学名的材料为对象，研究比较不同的DNA分子标记在石斛属植物中的分辨率及鉴定价值[4-15]，而将分子标记应用于品种混乱的干药材鉴别还鲜有报道。干燥石斛药材不同于新鲜材料，在干燥、加工、贮藏等过程均造成了DNA不同程度降解，同时药材中丰富的多糖、蛋白质及多酚类等成分都影响后续PCR扩增、酶切等相关研究，因此需要探索适合于石斛类药材的DNA提取分离方法，获得高质量的DNA，然后选取合适的DNA标记进行鉴定研究。
位于核基因组的rDNA ITS区因进化速率快，分辨率高，是植物条形码鉴别的重要候选基因片段。研究表明ITS序列在石斛属种间具有较大的变异，而在种内具有一定的遗传稳定性，是石斛物种鉴别的有效DNA分子标记[4，6-7，12，14]，而有关该片段直接用于石斛药材鉴定尚未见报道。本文基于本课题组积累与Genbank收载的石斛属植物ITS序列资料，在研究药材DNA提取方法基础上，从药材中扩增ITS序列，通过克隆测序获得药材序列，经过与同源序列比对分析，对石斛类药材的基原进行鉴别。
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1 材料
实验用石斛药材共计22批，包括12批切段的黄草，10批枫斗，分别购自于安徽、河北、广州、上海、浙江等地，现保存于上海中医药大学中药研究所，来源见表1。样品用蒸馏水与70%乙醇清洗表面，切成小碎块或者直接打粉备用。
2 方法
2.1 基因组DNA的提取 取石斛类药材干燥茎，将表面用无菌水冲洗干净，切成小碎块或者直接打粉，在液氮中进一步研磨成细粉，分别采用改良CTAB法(干药材约50 mg微量提取；干药材约500 mg大量提取)与试剂盒探索药材总DNA提取方法。
试剂盒提取：取干燥药材，加液氮碾磨成细分，取20 mg，根据QIAGEN试剂盒使用指南进行总DNA提取。
改良CTAB法提取：对经典CTAB方法进行改进，提高提取液中CTAB的浓度(由2%提高至3%)；将经典的氯仿萃取去除蛋白方法改进为苯酚-氯仿-异戊醇与氯仿-异戊醇结合使用去除蛋白。
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干燥药材切块或粉碎，加液氮碾磨成细粉，取约50 mg (微量提取)或500 mg(大量提取)细粉，迅速转移至离心管中，加入已65 ℃预热的CTAB提取液(3% CTAB；100 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0；1.4 mol·L-1 NaCl )，混匀。65 ℃保温2～4 h (期间多次轻轻颠倒混匀，使DNA提取充分 )，取出，冷却至室温，12 000 r·min-1室温离心10 min，吸取上清液，用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇 (25∶24∶1)萃取1次，吸取上清液；在上清液中加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1) 萃取液，上下多次颠倒，至萃取充分，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min；吸取上清液，加入氯仿-异戊醇(24∶1)重复萃取数次至两相间无沉淀物。吸取上清液加入1/10体积的3 mmol·L-1 NaAc与2～2.5倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，混匀，-20 ℃放置1～2 h，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min ，弃液，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次(4 ℃，5 000 r·min-1，离心5 min)，弃液，晾干，加入TE液 (10 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0) 溶解，-20 ℃保存备用。, http://www.100md.com(叶子 卢叶 王峥涛 徐红 胡之璧)