25—35诱导PC12细胞凋亡中的作用> PI3K/Akt通路在芍药苷抗Aβ25—35诱导P(1)
[摘要] 目的：研究PI3K/Akt通路在芍药苷对PC12细胞神经保护中的作用。方法：芍药苷组(5，10，20 μmol·L-1)预处理30 min，然后加入Aβ25-35(20 μmol·L-1)共同作用24 h；抑制剂LY294002(10 μmol·L-1)于芍药苷(10 μmol·L-1)作用前预处理30 min。用MTT比色法检测细胞存活率，Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率，以及Western blot法检测p-Akt，Bax，Bcl-2，cleaved caspase-3蛋白表达。结果：芍药苷可抑制Aβ25-35所诱导的PC12细胞毒性和凋亡，其保护作用可能是通过上调Akt磷酸化水平，增加Bcl-2蛋白表达、降低Bax蛋白表达、抑制caspase-3等的激活而实现的；抑制剂LY294002可减弱上述芍药苷的保护作用。结论：芍药苷可通过激活PI3K/Akt信号通路对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤具有保护作用。
, 百拇医药
[关键词]β淀粉样蛋白；芍药苷；阿尔茨海默病；PI3K/Akt 信号通路
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种以脑内胆碱能神经元的大量缺失和死亡为特点的神经退行性病变。Aβ淀粉样蛋白沉积是引起AD发病的主要因素，其引起的细胞凋亡在AD的发病机制中起重要作用。PI3K/Akt信号转导通路是一条重要的细胞存活信号通路，参与调节许多细胞凋亡的过程。Akt是原癌基因c-Akt的表达产物，它参与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)介导的信号过程，Akt的激活受PI3K调控。Akt处于这一通路的中心环节，是神经元存活、神经和血管新生、轴突以及树突形成、突触结构形成和突触间信息传递所必需[1]。当细胞面临氧化损伤时，PI3K/Akt通路的活化对细胞存活非常重要。活化的Akt可以保护细胞免受Aβ蛋白、6-OHDA等氧化性毒物诱导的细胞凋亡[2]。
, 百拇医药
Bcl-2位于线粒体膜上，是PI3K/Akt下游的抗凋亡蛋白。PI3K/Akt信号通路能直接诱导抗凋亡蛋白Bcl-2上调，抑制促凋亡成员如Bax或Bak等[3]。caspase-9也是Akt下游的靶基因，Akt能够磷酸化caspase-9使之灭活进而抑制caspase-9的活性，并进一步抑制caspase-9下游分子包括caspase-2，3，6，8，10引起的一系列的级联反应进而抗细胞凋亡[4]。因此，通过检测在PI3K/Akt通路中Bax，Bcl-2，cleaved caspase-3蛋白表达的变化，可反映出PI3K/Akt 通路的激活对于保护神经元损伤的重要性。
芍药苷是中药芍药的主要有效单体成分，具有清热凉血、散瘀止痛、活血化瘀、调节免疫等功能。近年来，本课题组已经证实芍药苷对Aβ25-35所诱导的PC12细胞损伤具有一定的保护作用[5]。而芍药苷能否激活PI3K/Akt 通路，以及激活的PI3K/Akt 通路是否介导了芍药苷的神经保护作用均未明了。因此，本实验通过建立Aβ25-35所致的PC12细胞凋亡损伤模型，观察PI3K/Akt 通路在芍药苷抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 芍药苷(西安昊轩生物科技有限公司，批号20110315，纯度98%)。PC12细胞株(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株)购自上海细胞所。胰蛋白酶、DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；Aβ25-35和四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；细胞裂解液、BCA蛋白含量检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；ECL检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)。一抗p-Akt，Akt，Bax，Bcl-2，cleaved caspase-3，β-actin，LY294002和二抗Anti-rabbit IgG购于Cell signal公司。其余试剂均为市售分析纯。
1.2 PC12细胞培养及其损伤模型的建立 PC12细胞复苏后接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，2～3 d换液1次。取对数生长期细胞用于实验。实验分组：将PC12细胞分为空白对照组、Aβ25-35模型组(20 μmol·L-1)及芍药苷组(5，10，20 μmol·L-1)，抑制剂LY294002终浓度为10 μmol·L-1。芍药苷预处理30 min，然后加入Aβ25-35共同作用24 h。每组6孔，每孔200 μL。LY294002于芍药苷(10 μmol·L-1)作用前预处理30 min，其余同上。
1.3 MTT法检测细胞存活率 收集对数期细胞，用胰酶将PC12细胞消化成单细胞悬液，并对细胞进行计数，将细胞制成2×105个/mL悬液，置于96孔培养板内，每孔200 μL(5×104个/孔)，细胞贴壁后给药，药物作用24 h后，每孔加5 g·L-1 MTT 20 μL，继续培4 h后，吸去上清液，每孔加150 μLDMSO，振摇10 min，使结晶充分溶解。在酶标仪上波长为570 nm处检测各孔吸光度。计算各种药物浓度的抑制率=[1-A给药组/A空白对照组)] ×100%。, http://www.100md.com(刘玲 王淑英 王建刚)
, 百拇医药
[关键词]β淀粉样蛋白；芍药苷；阿尔茨海默病；PI3K/Akt 信号通路
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种以脑内胆碱能神经元的大量缺失和死亡为特点的神经退行性病变。Aβ淀粉样蛋白沉积是引起AD发病的主要因素，其引起的细胞凋亡在AD的发病机制中起重要作用。PI3K/Akt信号转导通路是一条重要的细胞存活信号通路，参与调节许多细胞凋亡的过程。Akt是原癌基因c-Akt的表达产物，它参与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)介导的信号过程，Akt的激活受PI3K调控。Akt处于这一通路的中心环节，是神经元存活、神经和血管新生、轴突以及树突形成、突触结构形成和突触间信息传递所必需[1]。当细胞面临氧化损伤时，PI3K/Akt通路的活化对细胞存活非常重要。活化的Akt可以保护细胞免受Aβ蛋白、6-OHDA等氧化性毒物诱导的细胞凋亡[2]。
, 百拇医药
Bcl-2位于线粒体膜上，是PI3K/Akt下游的抗凋亡蛋白。PI3K/Akt信号通路能直接诱导抗凋亡蛋白Bcl-2上调，抑制促凋亡成员如Bax或Bak等[3]。caspase-9也是Akt下游的靶基因，Akt能够磷酸化caspase-9使之灭活进而抑制caspase-9的活性，并进一步抑制caspase-9下游分子包括caspase-2，3，6，8，10引起的一系列的级联反应进而抗细胞凋亡[4]。因此，通过检测在PI3K/Akt通路中Bax，Bcl-2，cleaved caspase-3蛋白表达的变化，可反映出PI3K/Akt 通路的激活对于保护神经元损伤的重要性。
芍药苷是中药芍药的主要有效单体成分，具有清热凉血、散瘀止痛、活血化瘀、调节免疫等功能。近年来，本课题组已经证实芍药苷对Aβ25-35所诱导的PC12细胞损伤具有一定的保护作用[5]。而芍药苷能否激活PI3K/Akt 通路，以及激活的PI3K/Akt 通路是否介导了芍药苷的神经保护作用均未明了。因此，本实验通过建立Aβ25-35所致的PC12细胞凋亡损伤模型，观察PI3K/Akt 通路在芍药苷抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 芍药苷(西安昊轩生物科技有限公司，批号20110315，纯度98%)。PC12细胞株(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株)购自上海细胞所。胰蛋白酶、DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；Aβ25-35和四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；细胞裂解液、BCA蛋白含量检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；ECL检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)。一抗p-Akt，Akt，Bax，Bcl-2，cleaved caspase-3，β-actin，LY294002和二抗Anti-rabbit IgG购于Cell signal公司。其余试剂均为市售分析纯。
1.2 PC12细胞培养及其损伤模型的建立 PC12细胞复苏后接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，2～3 d换液1次。取对数生长期细胞用于实验。实验分组：将PC12细胞分为空白对照组、Aβ25-35模型组(20 μmol·L-1)及芍药苷组(5，10，20 μmol·L-1)，抑制剂LY294002终浓度为10 μmol·L-1。芍药苷预处理30 min，然后加入Aβ25-35共同作用24 h。每组6孔，每孔200 μL。LY294002于芍药苷(10 μmol·L-1)作用前预处理30 min，其余同上。
1.3 MTT法检测细胞存活率 收集对数期细胞，用胰酶将PC12细胞消化成单细胞悬液，并对细胞进行计数，将细胞制成2×105个/mL悬液，置于96孔培养板内，每孔200 μL(5×104个/孔)，细胞贴壁后给药，药物作用24 h后，每孔加5 g·L-1 MTT 20 μL，继续培4 h后，吸去上清液，每孔加150 μLDMSO，振摇10 min，使结晶充分溶解。在酶标仪上波长为570 nm处检测各孔吸光度。计算各种药物浓度的抑制率=[1-A给药组/A空白对照组)] ×100%。, http://www.100md.com(刘玲 王淑英 王建刚)