生物样品前处理的研究进展(1)
[摘要] 合适的生物样品前处理技术可以真实地反映被测组分在机体内的作用规律，将为药物在体内的代谢过程、药效物质基础、作用机制、药理、毒理学等研究提供实验依据。生物样品包括血样、尿液、头发、泪液等，样品处理方法也很多，有直接的沉淀蛋白、液液萃取、固相萃取等，可以单独使用，也可以结合起来使用。
[关键词] 生物样品前处理； 研究进展； 展望
生物样品的预处理是药物分析最为关键的一步。通过预处理可以将缀合物(尿)或者结合物释放出来，以便测定药物的总浓度；可以纯化待测组分；可以更好地适应分析方法的灵敏性、专属性等；也能减少杂质对分析仪器的污染，达到提高仪器灵敏度、准确度、精密度等要求。生物样品包括动物组织、植物和微生物等。对于动物组织，先绞碎结缔组织、脂肪等非活性部分，然后选择合适的溶剂进行提取，必要时要破碎细胞。对于植物，要去壳、除脂。而对于微生物生物样品，要及时将菌体与发酵液分开。本文着重阐述一般的生物样品，包括血液、尿液、唾液、粪便以及各种组织，其中最常用的是血浆或血清，因为其可以较好地体现药物浓度和疗效之间的关系。其特点是成分极其复杂，包括基质、内源性物质及代谢产物等等，样品中含有数百种乃至几千种化合物，而要测定的药物浓度却很低， 往往处于ng～pg 级水平，甚至更低。此外，在分析生物样品之前还要经历分离、纯化及浓集，必要时还需对待测组分进行化学改性处理，以使待测物纯度达到仪器使用的基本要求[1]。步骤繁杂，耗时长，回收率不客观。基于以上特点，选择适合的前处理方法是实验的关键环节。
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目前，国内外最常见的生物样品前处理方法有以下几种，它们各自的优缺点如下。
1 沉淀蛋白
通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分提取和纯化的目的，也可以测定药物总浓度。去除蛋白质预防提取过程中蛋白质的发泡，可以减少乳化，另外还可以保护仪器，延长使用寿命。沉淀蛋白是体内药物分析工作的第一步。如应景艳将大鼠的五脏等组织取出后，吸取组织残留的血液然后加入0.9%的生理盐水研浆处理，1万 r·min-1离心10 min后吸取上清液[2] 。一般使用1～3倍体积的甲醇、乙腈、丙酮或乙醇等有机溶剂对蛋白进行沉淀。如果是水溶性的可以用酸类沉淀蛋白。有机溶剂沉淀蛋白的能力大小一般为乙腈>丙酮>乙醇>甲醇，由于乙腈和甲醇对液相和液-质的兼容性好，所以最常用的沉淀蛋白的有机溶剂为乙腈和甲醇[3]，其中乙腈可以提高被测组分的分离度，也能更好地改善峰形。另外，如果用高氯酸，如6%的高氯酸进行沉淀蛋白后，最好不要直接进色谱柱进行分析，应调节合适的pH然后过膜，再进样，以免由于酸性太强损伤柱子。与液液萃取相比，蛋白沉淀操作方便，但可能会稀释样品，降低灵敏度，且样品较脏。
, 百拇医药
李利群等[4]给大鼠灌胃和尾静脉注射红景天苷，取出血浆后用高氯酸沉淀蛋白，结果在24～150 000 μg·L-1线性关系良好，平均提取回收率为95.99%。
甲醇、乙醇、丙酮等水溶性溶剂能使蛋白质脱水，使得溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。用这种方法沉淀蛋白时要注意有机溶剂可能会溶解塑料，所以必要时要考察离心所用的容器[5]。另外，质谱的响应值与离子强度有关。生物样品中残存的杂质会导致待测物的离子化强度的改变，生物基质效应还受到动物个体的影响，采用液质联用时注意考察基质效应对样品的影响，采用与基质一致的成分进行标准曲线和质量控制样品的配制以减小差异[6]。
蛋白质是多价的两性电解质，通常在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电。电解质处于等电点时，分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。等电点沉淀分离法的基本原理即通过调节溶液的pH，使两性电解质的溶解度下降，从而使蛋白质阳离子形成不溶盐而沉淀。如饱和硫酸铵、硫酸钠等中性盐进行沉淀。当然盐溶液如果加入过多会使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，此时对于色谱分析仪器，要注意柱子容易堵塞的问题。
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蛋白质沉淀法操作简单，有较好的重复性，效率也较高，但是对于蛋白结合率较高的成分，会有回收率低的结果产生。此外，去除蛋白质的方法还有加入含锌盐及铜盐的沉淀剂法、酶水解法(如枯草杆菌酶)、加热法，但一般都很少用。
2 液-液提取
液-液提取包括液-液萃取、液-液回提(多次提取)、离子对提取。
液-液萃取(LLE)是在液体混合物中加入与其不相混溶(或稍相混溶)的溶剂，利用组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目的，又称溶剂萃取或抽提。由于多数药物是脂溶性的，而生物样品中的内源性物质是水溶性的，因而可以利用液-液萃取法除去大部分杂质，如应用于血浆、尿液、毛发样本的萃取等。实验者在选择溶剂时应注意按照相似相溶的原则；使用与水不互溶如乙醚等溶剂，防止带水溶性杂质；且溶剂纯度AR(分析纯)以上、无毒，沸点要低、易挥发和浓集，不影响紫外检测；还要有很好的化学稳定性。最好不要选择氯仿，易乳化且毒性大。如果被测定组分极性较小，可以选择正己烷等极性相对较弱的溶剂，相反，可以选择二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等[7]。
向贞兵等[8]取糖尿病模型大鼠全血加入0.3 mL的0.06 moL·L-1 HCl后，又经过乙酸乙酯和乙腈萃取，成功得到了以溴化苯甲酰噻唑的类似物为导向设计合成的化合物。回收率约80%左右，重复性也良好。Tabernero M J等[9]以25个滥用氯胺酮和安非他明的人的头发为样本，用0.1%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯冲洗，待干燥后，再用0.01% 甲酸超声4 h。液-质联用检测后，线性范围0.5～25 μg·L-1，检测限为0.1 μg·L-1。, 百拇医药(冯健男 杜守颖 白洁 陆洋 刘慧敏)
[关键词] 生物样品前处理； 研究进展； 展望
生物样品的预处理是药物分析最为关键的一步。通过预处理可以将缀合物(尿)或者结合物释放出来，以便测定药物的总浓度；可以纯化待测组分；可以更好地适应分析方法的灵敏性、专属性等；也能减少杂质对分析仪器的污染，达到提高仪器灵敏度、准确度、精密度等要求。生物样品包括动物组织、植物和微生物等。对于动物组织，先绞碎结缔组织、脂肪等非活性部分，然后选择合适的溶剂进行提取，必要时要破碎细胞。对于植物，要去壳、除脂。而对于微生物生物样品，要及时将菌体与发酵液分开。本文着重阐述一般的生物样品，包括血液、尿液、唾液、粪便以及各种组织，其中最常用的是血浆或血清，因为其可以较好地体现药物浓度和疗效之间的关系。其特点是成分极其复杂，包括基质、内源性物质及代谢产物等等，样品中含有数百种乃至几千种化合物，而要测定的药物浓度却很低， 往往处于ng～pg 级水平，甚至更低。此外，在分析生物样品之前还要经历分离、纯化及浓集，必要时还需对待测组分进行化学改性处理，以使待测物纯度达到仪器使用的基本要求[1]。步骤繁杂，耗时长，回收率不客观。基于以上特点，选择适合的前处理方法是实验的关键环节。
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目前，国内外最常见的生物样品前处理方法有以下几种，它们各自的优缺点如下。
1 沉淀蛋白
通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分提取和纯化的目的，也可以测定药物总浓度。去除蛋白质预防提取过程中蛋白质的发泡，可以减少乳化，另外还可以保护仪器，延长使用寿命。沉淀蛋白是体内药物分析工作的第一步。如应景艳将大鼠的五脏等组织取出后，吸取组织残留的血液然后加入0.9%的生理盐水研浆处理，1万 r·min-1离心10 min后吸取上清液[2] 。一般使用1～3倍体积的甲醇、乙腈、丙酮或乙醇等有机溶剂对蛋白进行沉淀。如果是水溶性的可以用酸类沉淀蛋白。有机溶剂沉淀蛋白的能力大小一般为乙腈>丙酮>乙醇>甲醇，由于乙腈和甲醇对液相和液-质的兼容性好，所以最常用的沉淀蛋白的有机溶剂为乙腈和甲醇[3]，其中乙腈可以提高被测组分的分离度，也能更好地改善峰形。另外，如果用高氯酸，如6%的高氯酸进行沉淀蛋白后，最好不要直接进色谱柱进行分析，应调节合适的pH然后过膜，再进样，以免由于酸性太强损伤柱子。与液液萃取相比，蛋白沉淀操作方便，但可能会稀释样品，降低灵敏度，且样品较脏。
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李利群等[4]给大鼠灌胃和尾静脉注射红景天苷，取出血浆后用高氯酸沉淀蛋白，结果在24～150 000 μg·L-1线性关系良好，平均提取回收率为95.99%。
甲醇、乙醇、丙酮等水溶性溶剂能使蛋白质脱水，使得溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。用这种方法沉淀蛋白时要注意有机溶剂可能会溶解塑料，所以必要时要考察离心所用的容器[5]。另外，质谱的响应值与离子强度有关。生物样品中残存的杂质会导致待测物的离子化强度的改变，生物基质效应还受到动物个体的影响，采用液质联用时注意考察基质效应对样品的影响，采用与基质一致的成分进行标准曲线和质量控制样品的配制以减小差异[6]。
蛋白质是多价的两性电解质，通常在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电。电解质处于等电点时，分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。等电点沉淀分离法的基本原理即通过调节溶液的pH，使两性电解质的溶解度下降，从而使蛋白质阳离子形成不溶盐而沉淀。如饱和硫酸铵、硫酸钠等中性盐进行沉淀。当然盐溶液如果加入过多会使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，此时对于色谱分析仪器，要注意柱子容易堵塞的问题。
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蛋白质沉淀法操作简单，有较好的重复性，效率也较高，但是对于蛋白结合率较高的成分，会有回收率低的结果产生。此外，去除蛋白质的方法还有加入含锌盐及铜盐的沉淀剂法、酶水解法(如枯草杆菌酶)、加热法，但一般都很少用。
2 液-液提取
液-液提取包括液-液萃取、液-液回提(多次提取)、离子对提取。
液-液萃取(LLE)是在液体混合物中加入与其不相混溶(或稍相混溶)的溶剂，利用组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目的，又称溶剂萃取或抽提。由于多数药物是脂溶性的，而生物样品中的内源性物质是水溶性的，因而可以利用液-液萃取法除去大部分杂质，如应用于血浆、尿液、毛发样本的萃取等。实验者在选择溶剂时应注意按照相似相溶的原则；使用与水不互溶如乙醚等溶剂，防止带水溶性杂质；且溶剂纯度AR(分析纯)以上、无毒，沸点要低、易挥发和浓集，不影响紫外检测；还要有很好的化学稳定性。最好不要选择氯仿，易乳化且毒性大。如果被测定组分极性较小，可以选择正己烷等极性相对较弱的溶剂，相反，可以选择二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等[7]。
向贞兵等[8]取糖尿病模型大鼠全血加入0.3 mL的0.06 moL·L-1 HCl后，又经过乙酸乙酯和乙腈萃取，成功得到了以溴化苯甲酰噻唑的类似物为导向设计合成的化合物。回收率约80%左右，重复性也良好。Tabernero M J等[9]以25个滥用氯胺酮和安非他明的人的头发为样本，用0.1%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯冲洗，待干燥后，再用0.01% 甲酸超声4 h。液-质联用检测后，线性范围0.5～25 μg·L-1，检测限为0.1 μg·L-1。, 百拇医药(冯健男 杜守颖 白洁 陆洋 刘慧敏)