3种不同基原藏药沙棘的1H—NMR代谢组学研究(1)
[摘要] 运用1H-NMR代谢组学方法，建立藏药沙棘的氢核磁共振指纹图谱，明确不同基原之间的整体代谢物差异，为其质量评价提供新方法。利用核磁共振仪测定不同基原的沙棘药材，将所得自由衰减信号导入MestReNova软件进行分段积分，数据归一化后进行主成分(PCA)分析和偏最小二乘法(PLS-DA)分析，结果显示3种不同品种沙棘能够明显分开，L-白雀木醇、苹果酸和部分未鉴定的糖类成分是引起3个品种分类的差异代谢物。该研究鉴定出25个代谢产物，包括黄酮类、三萜类、氨基酸类、糖类、脂肪酸类等成分。1H-NMR分析方法具有整体性的特征，并且样品制备简单、分析快速、重复性好，建立的指纹图可以为藏药沙棘药材的质量控制与评价提供参考依据。
[关键词] 藏药沙棘； 1H-NMR代谢组学；化学计量学；质量控制
沙棘为胡颓子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L.的干燥成熟果实，具有健脾消食，止咳化痰，活血化瘀之功效，常用于脾虚食少，咳嗽痰多，胸痹心痛，跌打瘀肿等[1]。沙棘属植物品种繁多，分布地域广泛，不同品种分布地域区间跨度大，这些因素直接导致了沙棘药材基原的复杂性[2-4]。目前沙棘药材的质量控制主要是采用HPLC对黄酮类成分进行含量测定或指纹图研究[5-6]。1H-NMR的优势在于能较全面的检测药材的整体化学成分，测定快速准确，专属性强等。1H-NMR代谢组学技术已成功应用于人参[7]、黄连[8]、泽泻[9]等药材质量控制与评价。本文采用1H-NMR代谢物组学技术，研究中国沙棘H. rhamnoides L. subsp.sinensis Rousi.、西藏沙棘H.tibetana Schlechtend.、江孜沙棘H. rhamnoides L.subsp. gyantsensis Rousi药材的代谢成分，结合PCA，PLS-DA等化学计量学方法研究不同基原沙棘药材的代谢物差异，最终建立其代谢指纹图谱，找出引起种间差异性的标志物，为藏药沙棘药材的质量控制研究提供参考。
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1 材料与方法
1.1 仪器、软件和试药
Agilent Technologies 600/54 Premium Compact(600 MHz) 核磁共振波谱仪(美国Agilent公司)；MestReNova(version 9.0， Mestrelabs Research SL， Santiago de Compostela， Spain) 软件， SIMCA-P(version 11.5， Umetrics， Ume， Sweden)软件，Sartorius BP 221 S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-300 B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司，孔径0.45 μm，有机系)；氘代甲醇、重水(色谱纯，北京京云重轻科技有限公司)，3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸钠(TSP，美国Sigma-Aldrich公司)；槲皮素、山柰素、异鼠李素、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为H-009-130126，S-064—130518，Y-039-130326，S-063-130114)；槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、齐墩果酸对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-13040302，MUST-13021811，MUST-13022011，MUST-13041606)。
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1.2 沙棘药材来源
本研究主要收集了四川、甘肃、青海、西藏4个不同产地的沙棘药材，共42个批次，药材经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为胡颓子科植物沙棘中国沙棘H. rhamnoides L. subsp.sinensis Rousi.、西藏沙棘H.tibetana Schlechtend.、江孜沙棘H. rhamnoides L.subsp. gyantsensis Rousi的干燥成熟果实，详见表1。
1.3 方法
1.3.1 供试品溶液的制备 取干燥的药材粉末0.2 g，置于锥形瓶中，分别加入0.3 mL D2O溶液(内含12.32 g·L-1 KH2PO4和0.04% TSP)和1 mL CD3OD，密封，超声提取30 min，取出，放冷，过0.45 μm微孔滤膜，精密吸取0.6 mL滤液至标准的5 mm核磁管中，待测。
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1.3.2 1H-NMR测定条件 测定温度 25 ℃；观察频率 600 MHz；各项参数扫描次数(nt)128；谱线宽度(lb)0.5 Hz；弛豫时间(d1)2 s；FID转换所需点数(fn)65 536；FID信号采集时间(at)1.703 9 s；谱宽(sw)9 615.4 Hz；调用水峰压制序列(Presat)压制水峰信号，总测定时间为9 min 5 s。
1.3.3 数据处理 将经NMR仪检测得到的1H-NMR 自由衰减(FID)信号导入MestReNova 软件进行自动傅立叶转换，手动调整相位与基线，以内标物TSP为基准校正化学位移，选择δ 0.5～10.5范围的1H-NMR图并以每δ 0.04作为1个单位进行分段积分，并对总峰面积作归一化处理，最后以ASCII格式输出数据，得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值。本试验共获得242段积分(扣除2段甲醇峰信号δ 3.26～3.34和4段水峰信号δ 4.74～4.90)。将获得的数据矩阵(242个变量×42个样品)，导入 SIMCA-P软件进行PCA分析与PLS-DA分析。, 百拇医药(苏永文 谭尔 张静 游佳莉 刘悦 刘川 周向东 张艺)
[关键词] 藏药沙棘； 1H-NMR代谢组学；化学计量学；质量控制
沙棘为胡颓子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L.的干燥成熟果实，具有健脾消食，止咳化痰，活血化瘀之功效，常用于脾虚食少，咳嗽痰多，胸痹心痛，跌打瘀肿等[1]。沙棘属植物品种繁多，分布地域广泛，不同品种分布地域区间跨度大，这些因素直接导致了沙棘药材基原的复杂性[2-4]。目前沙棘药材的质量控制主要是采用HPLC对黄酮类成分进行含量测定或指纹图研究[5-6]。1H-NMR的优势在于能较全面的检测药材的整体化学成分，测定快速准确，专属性强等。1H-NMR代谢组学技术已成功应用于人参[7]、黄连[8]、泽泻[9]等药材质量控制与评价。本文采用1H-NMR代谢物组学技术，研究中国沙棘H. rhamnoides L. subsp.sinensis Rousi.、西藏沙棘H.tibetana Schlechtend.、江孜沙棘H. rhamnoides L.subsp. gyantsensis Rousi药材的代谢成分，结合PCA，PLS-DA等化学计量学方法研究不同基原沙棘药材的代谢物差异，最终建立其代谢指纹图谱，找出引起种间差异性的标志物，为藏药沙棘药材的质量控制研究提供参考。
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1 材料与方法
1.1 仪器、软件和试药
Agilent Technologies 600/54 Premium Compact(600 MHz) 核磁共振波谱仪(美国Agilent公司)；MestReNova(version 9.0， Mestrelabs Research SL， Santiago de Compostela， Spain) 软件， SIMCA-P(version 11.5， Umetrics， Ume， Sweden)软件，Sartorius BP 221 S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-300 B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司，孔径0.45 μm，有机系)；氘代甲醇、重水(色谱纯，北京京云重轻科技有限公司)，3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸钠(TSP，美国Sigma-Aldrich公司)；槲皮素、山柰素、异鼠李素、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为H-009-130126，S-064—130518，Y-039-130326，S-063-130114)；槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、齐墩果酸对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-13040302，MUST-13021811，MUST-13022011，MUST-13041606)。
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1.2 沙棘药材来源
本研究主要收集了四川、甘肃、青海、西藏4个不同产地的沙棘药材，共42个批次，药材经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为胡颓子科植物沙棘中国沙棘H. rhamnoides L. subsp.sinensis Rousi.、西藏沙棘H.tibetana Schlechtend.、江孜沙棘H. rhamnoides L.subsp. gyantsensis Rousi的干燥成熟果实，详见表1。
1.3 方法
1.3.1 供试品溶液的制备 取干燥的药材粉末0.2 g，置于锥形瓶中，分别加入0.3 mL D2O溶液(内含12.32 g·L-1 KH2PO4和0.04% TSP)和1 mL CD3OD，密封，超声提取30 min，取出，放冷，过0.45 μm微孔滤膜，精密吸取0.6 mL滤液至标准的5 mm核磁管中，待测。
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1.3.2 1H-NMR测定条件 测定温度 25 ℃；观察频率 600 MHz；各项参数扫描次数(nt)128；谱线宽度(lb)0.5 Hz；弛豫时间(d1)2 s；FID转换所需点数(fn)65 536；FID信号采集时间(at)1.703 9 s；谱宽(sw)9 615.4 Hz；调用水峰压制序列(Presat)压制水峰信号，总测定时间为9 min 5 s。
1.3.3 数据处理 将经NMR仪检测得到的1H-NMR 自由衰减(FID)信号导入MestReNova 软件进行自动傅立叶转换，手动调整相位与基线，以内标物TSP为基准校正化学位移，选择δ 0.5～10.5范围的1H-NMR图并以每δ 0.04作为1个单位进行分段积分，并对总峰面积作归一化处理，最后以ASCII格式输出数据，得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值。本试验共获得242段积分(扣除2段甲醇峰信号δ 3.26～3.34和4段水峰信号δ 4.74～4.90)。将获得的数据矩阵(242个变量×42个样品)，导入 SIMCA-P软件进行PCA分析与PLS-DA分析。, 百拇医药(苏永文 谭尔 张静 游佳莉 刘悦 刘川 周向东 张艺)