长期服用人参皂苷大鼠尿液代谢组学研究(1)
[摘要] 人参因对机体的整体调节和促进作用，其长期服用具有一定滋补功效。然而其滋补作用的靶点以及长期服用对于机体可能带来的毒副作用并不是很明确，尿液代谢组学的方法因其非侵入、同时监测机体整体代谢状态的特点，适用于中药的长期药效及药理毒理研究。该研究以实验大鼠为对象，利用代谢组学技术分析其尿液代谢物组成的动态变化，分析长期服用人参主要有效成分——人参总皂苷对大鼠机体尿液代谢谱的影响。结果显示短期和长期服用人参皂苷均不会对正常大鼠尿液的代谢组造成非常显著的影响(主成分分析分组不能成功建模)，相比之下，服用人参皂苷在短期内(1～3周)对机体尿液的代谢谱影响最大，包括能量代谢、儿茶酚胺类物质以及氨基酸类神经递质代谢，中期(6～10周)作用的逐渐减小，长期(27周)几乎无作用，同时证明短期和长期服用人参皂苷对机体无明显的毒副作用。
[关键词] 人参皂苷;尿液;代谢组学
[收稿日期] 2014-04-18
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30901997);上海交通大学SMC-晨星学者计划项目(B类);国家重点基础研究发展计划项目(2012CB910102)
[通信作者] *王晓艳，副研究员，主要从事中药药理与代谢组学研究，Tel/Fax：(021)34207343，E-mail：cathywxy@sjtu.edu.cn
人参学名Panax ginseng，又被称为亚洲参，因其珍贵的药用价值被称为“百草之王”，多年来一直是中外学者的研究热点[1]。《本草纲目》中提到人参能治一切机体虚症，《神农本草经》中也认为，人参有“补五脏、定魂魄、安精神、除邪气、止惊悸、明目益智”的功效，“久服轻身延年”，对于体弱多病的人尤其疗效显著，对于正常人群也适宜用作冬季进补和春季养阳。人参发挥滋补作用的关键在于每次少量，连续服用一段时间为宜[2]。人参的主要药效成分包括皂苷类、有机酸及其酯化产物、挥发油、甾醇、氨基酸、多肽、糖类、维生素类、黄酮类、微量元素、木质素等，而其中皂苷类物质含量最高，侧根部分总皂苷含量可达60%，被认为是人参药材的主要功效成分[3]。
, 百拇医药
人参皂苷(ginsenoside)是一种固醇类的三萜皂苷，对机体生理调节功能非常广泛，包括物质代谢、免疫激素和内分泌系统、脑和神经系统、生殖系统和胃肠道系统等[3]。因此用一种方法能够动态监测其对机体多个系统长期作用的影响，将有助于阐明人参皂苷滋补功效的作用靶点，并能发现其长期服用可能带来的毒副作用。
代谢组学作为系统生物学一个重要的分支，考察不同时刻受过不同外界环境刺激或扰动的生物体系的代谢组进而研究生物体系代谢通路变化的一门组学学科[4-5]。因其易标准化的特性现已广泛应用于疾病诊断、毒性研究、营养学研究、环境研究等许多领域。前期的代谢组学研究表明人参皂苷类物质能够调节机体内神经递质相关代谢物的表达水平，从而达到抵御应激、疲劳、衰老和癌症的功效[6-7]。本研究通过对大鼠进行为期27周的人参皂苷喂养，分析尿液中代谢物组成随时间的变化，研究短期和长期服用人参皂苷对机体整体代谢的影响。
1 材料
, 百拇医药
1.1 实验动物 洁净级Wistar雄性大鼠23只，300 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，大鼠于室内保持12 h/12 h昼夜并给予标准饲养，控制室内相对湿度在40%左右。
1.2 试剂及药品 人参总皂苷(纯度大于85%)购自湖南诺泽生物科技有限公司。尿素酶，分析纯十七酸，分析纯氯苯丙胺酸，分析纯甲氧胺，分析纯吡啶购自Sigma-Aldrich公司，色谱纯甲醇购自Merck公司，硅烷化试剂BSFTA购自安普生物科技有限公司。
1.3 仪器 气相色谱-质谱联用仪(气相色谱仪为Agilent 6890N型号，飞行时间质谱仪为Leco Pegsus HT型号);大鼠新型代谢笼(苏州市冯氏实验动物设备有限公司);5415R冷冻离心机(德国Eppendorf公司);Milli.Q Adventage超纯水系统;Forma-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo公司);XS105精密称量天平(美国Mettler toledo公司)。
, 百拇医药
2 方法
2.1 实验动物和给药 将23只雄性Wistar(34周)大鼠，适应培养1周后随机分成空白对照组(12只，C组)和人参皂苷组(11只，CT组)从实验第1天开始，C组服用蒸馏水，CT组服用人参总皂苷100 mg·kg-1。
2.2 尿液样本收集 分别在服药前24 h(0周)服药后1，3，6，10，27周，将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。将原始尿液样本在3 000 r·min-1下离心10 min，之后取尿液上清分装，置于-80 ℃冰箱保存。
2.3 尿液的GC/TOF分析 本次实验采用三甲基硅烷化(TMS)衍生化GC-MS方法测定大鼠尿样中小分子内源性代谢物质[8]。尿液样本解冻后，涡旋混匀离心12 000 r·min-1 10 min。取上清50 μL，加入10 μL尿素酶，37 ℃反应15 min。加入1 g·L-1的十七酸(内标)10 μL，0.3 g·L-1氯苯丙氨酸(内标)10 μL，振荡离心5 min，取上清于室温下真空干燥，加甲氧胺和BSFTA 80 μL， 70 ℃反应60 min。室温下放置1 h后进样分析。
2.4 图谱数据处理和建模 以相似度≥700为标准，利用自建的标品库和商业谱库鉴定GC-MS总离子图谱中每个代谢物峰归属。将得到的样品的GC-MS总离子图谱文件通过数据转换、峰辨识、对齐和归一化等计算过程，最终得到一个由指定的峰序列号、观测点以及归一化后的峰强度组成的三维矩阵，将其导入SIMCA-P 13.0软件中进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)鉴别造成聚集和离散的主要差异变量(VIP>1)同时辅以CT组与C组同一代谢物峰面积相比差异倍数(Fold Change)和单维T-test检验来观察各个差异在各个时间点的变化[8]。, 百拇医药(谢燮 陈少秋 吕颖芳 王晓艳 贾伟)
[关键词] 人参皂苷;尿液;代谢组学
[收稿日期] 2014-04-18
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[基金项目] 国家自然科学基金项目(30901997);上海交通大学SMC-晨星学者计划项目(B类);国家重点基础研究发展计划项目(2012CB910102)
[通信作者] *王晓艳，副研究员，主要从事中药药理与代谢组学研究，Tel/Fax：(021)34207343，E-mail：cathywxy@sjtu.edu.cn
人参学名Panax ginseng，又被称为亚洲参，因其珍贵的药用价值被称为“百草之王”，多年来一直是中外学者的研究热点[1]。《本草纲目》中提到人参能治一切机体虚症，《神农本草经》中也认为，人参有“补五脏、定魂魄、安精神、除邪气、止惊悸、明目益智”的功效，“久服轻身延年”，对于体弱多病的人尤其疗效显著，对于正常人群也适宜用作冬季进补和春季养阳。人参发挥滋补作用的关键在于每次少量，连续服用一段时间为宜[2]。人参的主要药效成分包括皂苷类、有机酸及其酯化产物、挥发油、甾醇、氨基酸、多肽、糖类、维生素类、黄酮类、微量元素、木质素等，而其中皂苷类物质含量最高，侧根部分总皂苷含量可达60%，被认为是人参药材的主要功效成分[3]。
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人参皂苷(ginsenoside)是一种固醇类的三萜皂苷，对机体生理调节功能非常广泛，包括物质代谢、免疫激素和内分泌系统、脑和神经系统、生殖系统和胃肠道系统等[3]。因此用一种方法能够动态监测其对机体多个系统长期作用的影响，将有助于阐明人参皂苷滋补功效的作用靶点，并能发现其长期服用可能带来的毒副作用。
代谢组学作为系统生物学一个重要的分支，考察不同时刻受过不同外界环境刺激或扰动的生物体系的代谢组进而研究生物体系代谢通路变化的一门组学学科[4-5]。因其易标准化的特性现已广泛应用于疾病诊断、毒性研究、营养学研究、环境研究等许多领域。前期的代谢组学研究表明人参皂苷类物质能够调节机体内神经递质相关代谢物的表达水平，从而达到抵御应激、疲劳、衰老和癌症的功效[6-7]。本研究通过对大鼠进行为期27周的人参皂苷喂养，分析尿液中代谢物组成随时间的变化，研究短期和长期服用人参皂苷对机体整体代谢的影响。
1 材料
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1.1 实验动物 洁净级Wistar雄性大鼠23只，300 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，大鼠于室内保持12 h/12 h昼夜并给予标准饲养，控制室内相对湿度在40%左右。
1.2 试剂及药品 人参总皂苷(纯度大于85%)购自湖南诺泽生物科技有限公司。尿素酶，分析纯十七酸，分析纯氯苯丙胺酸，分析纯甲氧胺，分析纯吡啶购自Sigma-Aldrich公司，色谱纯甲醇购自Merck公司，硅烷化试剂BSFTA购自安普生物科技有限公司。
1.3 仪器 气相色谱-质谱联用仪(气相色谱仪为Agilent 6890N型号，飞行时间质谱仪为Leco Pegsus HT型号);大鼠新型代谢笼(苏州市冯氏实验动物设备有限公司);5415R冷冻离心机(德国Eppendorf公司);Milli.Q Adventage超纯水系统;Forma-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo公司);XS105精密称量天平(美国Mettler toledo公司)。
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2 方法
2.1 实验动物和给药 将23只雄性Wistar(34周)大鼠，适应培养1周后随机分成空白对照组(12只，C组)和人参皂苷组(11只，CT组)从实验第1天开始，C组服用蒸馏水，CT组服用人参总皂苷100 mg·kg-1。
2.2 尿液样本收集 分别在服药前24 h(0周)服药后1，3，6，10，27周，将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。将原始尿液样本在3 000 r·min-1下离心10 min，之后取尿液上清分装，置于-80 ℃冰箱保存。
2.3 尿液的GC/TOF分析 本次实验采用三甲基硅烷化(TMS)衍生化GC-MS方法测定大鼠尿样中小分子内源性代谢物质[8]。尿液样本解冻后，涡旋混匀离心12 000 r·min-1 10 min。取上清50 μL，加入10 μL尿素酶，37 ℃反应15 min。加入1 g·L-1的十七酸(内标)10 μL，0.3 g·L-1氯苯丙氨酸(内标)10 μL，振荡离心5 min，取上清于室温下真空干燥，加甲氧胺和BSFTA 80 μL， 70 ℃反应60 min。室温下放置1 h后进样分析。
2.4 图谱数据处理和建模 以相似度≥700为标准，利用自建的标品库和商业谱库鉴定GC-MS总离子图谱中每个代谢物峰归属。将得到的样品的GC-MS总离子图谱文件通过数据转换、峰辨识、对齐和归一化等计算过程，最终得到一个由指定的峰序列号、观测点以及归一化后的峰强度组成的三维矩阵，将其导入SIMCA-P 13.0软件中进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)鉴别造成聚集和离散的主要差异变量(VIP>1)同时辅以CT组与C组同一代谢物峰面积相比差异倍数(Fold Change)和单维T-test检验来观察各个差异在各个时间点的变化[8]。, 百拇医药(谢燮 陈少秋 吕颖芳 王晓艳 贾伟)