基于生物效价和整合溶出度的六味五灵片体外溶出度研究(1)
[摘要]为了探讨化学-生物联合评价六味五灵片体外溶出度的可行性，该实验考察在0.1%SDS溶出介质中，不同溶出时间的六味五灵片溶出液对LX-2肝星状细胞的抑制作用，提出基于细胞抑制率所得六味五灵片的累积溶出度，与HPLC所测的五味子甲素、特女贞苷、连翘苷各指标成分的溶出度及自定义权重系数的多成分整合的溶出度运用f2相似因子法分别进行相关性评价。结果显示，五味子甲素、连翘苷、特女贞苷各指标成分和整合溶出度与生物溶出度相比较，f2相似因子依次为61，43，61，75，说明多成分整合的溶出度能更全面地反映全方的生物效价，以生物活性为导向的多成分整合的溶出度评价方法有望成为评价六味五灵片体外溶出度的有效手段之一。
[关键词]整合溶出度；生物评价；六味五灵片；f2相似因子
六味五灵片(LWT)由五味子、女贞子、连翘、莪术、苣荬菜、灵芝孢子粉组成，可滋肾养肝，活血解毒，临床上常用于治疗慢性乙型肝炎[1]。近年来，大量的临床研究发现六味五灵片具有良好的抗肝纤维化作用[2-4]。但其活性效成分及作用机制尚不清楚，且现有质量标准仅把五味子甲素作为质量控制的指标成分，这种“惟成分论”的质量评价模式，仅能控制部分指标性成分的一致性和稳定性，难以完全、有效地评价药物的质量。
溶出度检测已成为评价制剂处方和生产工艺的重要手段，同时也是评价制剂活性成分生物利用度和药物质量的内在指标[5-6]。中药固体制剂的溶出度评价研究较少，通常是借鉴化学药质量控制模式对单个或少数指标成分的量进行分析测定[7]。由于中药复方固体制剂的药效是多成分协同作用的结果，单纯检测一种或几种指标成分的溶出度会导致与整体药效的偏差，不能完全衡量中药固体制剂的质量[8]。而生物效价检测方法能够快速反映药物临床活性，用于评价中药品质及药性的研究。所以，近年来又有相关文献采用生物效价-多成分整合的体外溶出度评价模式，如复方鳖甲软肝片[9]、冬虫夏草[10]等，这种评价模式能够更为全面的评价药物的质量。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法是一种细菌活性检测方法，该方法除具有操作简单、工作量小、快速的优点外，还能降低成本，因此本试验采用MTT比色法联合多成分整合的体外溶出度评价模式对六味五灵片的质量进行评价。
1材料
BSA124S型精密电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；RC-6型溶出度测试仪(天津新天光技术开发有限公司)；XDS-1B型倒置生物显微镜(北京京瑞天下科技有限公司)；FormaSeriesⅡ水CO2培养箱(3110SeriesⅡ水套，ThermoFisher)；全波长酶标仪(MultiskanGO型，ThermoScientific)；LX-2肝星状细胞(北京协和细胞资源中心)；
LX-2肝星状细胞(北京协和细胞资源中心)；六味五灵片(山东世博金都药业有限公司，批号140510)；五味子甲素(批号0764-9603)，连翘苷(批号110821-200508)，特女贞苷对照品(批号112927-202003)均购自中国食品药品检定研究院；色谱甲醇(Oceanpak，瑞典)，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1HPLC定量方法的建立
2.1.1色谱条件色谱柱为AlltimaC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，室温(30℃)，进样量10μL。五味子甲素：流动相甲醇-0.1%磷酸(75∶25)，检测波长250nm，流速1.0mL·min-1；连翘苷：流动相乙腈-水(25∶75)，检测波长277nm，流速1.0mL·min-1。特女贞苷：流动相甲醇-水(34∶66)，检测波长224nm，流速0.8mL·min-1。
2.1.2对照品溶液的制备分别精密称取对照品五味子甲素、连翘苷、特女贞苷适量，置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，即得质量浓度分别为188，816，200mg·L-1的对照品母液。再分别精密吸取上述储备液1mL于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得质量浓度分别为18.8，81.6，20mg·L-1的对照品储备液备用。
2.1.3供试品溶液的制备分别取六味五灵片6片，按照溶出度测定法(《中国药典》2010年版附录XC第二法)[11]，以脱气处理的0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)200mL为溶出介质，转速为100r·min-1，依法操作，30min时，取样2mL，立即用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.1.4阴性对照溶液的制备按处方中药材比例，取除五味子、连翘、女贞子外的其他药材，按其工艺制成不含五味子、连翘、女贞子的阴性制剂。再按2.1.3项下方法制备，即得阴性对照溶液。
2.1.5专属性考察分别将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按2.1.1项下方法进行测定，供试品溶液中五味子甲素、连翘苷、特女贞苷与其他组分色谱峰达到基线分离，且阴性对照溶液在与对照品相同保留时间处无色谱峰，因此可认为处方中其他药材与辅料对此3种成分的测定无干扰，色谱图见图1。
2.1.6线性关系考察精密吸取18.8mg·L-1的五味子甲素对照品储备液适量，用甲醇稀释得0.0376，1.504，3.008，6.016，7.52mg·L-1的系列对照品溶液，分别吸取上述溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程Y=43353X-5779.1，R2=0.9997，表明其在0.376～7.52mg·L-1线性关系良好。 (郑娟 程玲 沈成英 李娟娟 邱玲 沈刚 韩晋 袁海龙)
[关键词]整合溶出度；生物评价；六味五灵片；f2相似因子
六味五灵片(LWT)由五味子、女贞子、连翘、莪术、苣荬菜、灵芝孢子粉组成，可滋肾养肝，活血解毒，临床上常用于治疗慢性乙型肝炎[1]。近年来，大量的临床研究发现六味五灵片具有良好的抗肝纤维化作用[2-4]。但其活性效成分及作用机制尚不清楚，且现有质量标准仅把五味子甲素作为质量控制的指标成分，这种“惟成分论”的质量评价模式，仅能控制部分指标性成分的一致性和稳定性，难以完全、有效地评价药物的质量。
溶出度检测已成为评价制剂处方和生产工艺的重要手段，同时也是评价制剂活性成分生物利用度和药物质量的内在指标[5-6]。中药固体制剂的溶出度评价研究较少，通常是借鉴化学药质量控制模式对单个或少数指标成分的量进行分析测定[7]。由于中药复方固体制剂的药效是多成分协同作用的结果，单纯检测一种或几种指标成分的溶出度会导致与整体药效的偏差，不能完全衡量中药固体制剂的质量[8]。而生物效价检测方法能够快速反映药物临床活性，用于评价中药品质及药性的研究。所以，近年来又有相关文献采用生物效价-多成分整合的体外溶出度评价模式，如复方鳖甲软肝片[9]、冬虫夏草[10]等，这种评价模式能够更为全面的评价药物的质量。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法是一种细菌活性检测方法，该方法除具有操作简单、工作量小、快速的优点外，还能降低成本，因此本试验采用MTT比色法联合多成分整合的体外溶出度评价模式对六味五灵片的质量进行评价。
1材料
BSA124S型精密电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；RC-6型溶出度测试仪(天津新天光技术开发有限公司)；XDS-1B型倒置生物显微镜(北京京瑞天下科技有限公司)；FormaSeriesⅡ水CO2培养箱(3110SeriesⅡ水套，ThermoFisher)；全波长酶标仪(MultiskanGO型，ThermoScientific)；LX-2肝星状细胞(北京协和细胞资源中心)；
LX-2肝星状细胞(北京协和细胞资源中心)；六味五灵片(山东世博金都药业有限公司，批号140510)；五味子甲素(批号0764-9603)，连翘苷(批号110821-200508)，特女贞苷对照品(批号112927-202003)均购自中国食品药品检定研究院；色谱甲醇(Oceanpak，瑞典)，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1HPLC定量方法的建立
2.1.1色谱条件色谱柱为AlltimaC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，室温(30℃)，进样量10μL。五味子甲素：流动相甲醇-0.1%磷酸(75∶25)，检测波长250nm，流速1.0mL·min-1；连翘苷：流动相乙腈-水(25∶75)，检测波长277nm，流速1.0mL·min-1。特女贞苷：流动相甲醇-水(34∶66)，检测波长224nm，流速0.8mL·min-1。
2.1.2对照品溶液的制备分别精密称取对照品五味子甲素、连翘苷、特女贞苷适量，置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，即得质量浓度分别为188，816，200mg·L-1的对照品母液。再分别精密吸取上述储备液1mL于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得质量浓度分别为18.8，81.6，20mg·L-1的对照品储备液备用。
2.1.3供试品溶液的制备分别取六味五灵片6片，按照溶出度测定法(《中国药典》2010年版附录XC第二法)[11]，以脱气处理的0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)200mL为溶出介质，转速为100r·min-1，依法操作，30min时，取样2mL，立即用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.1.4阴性对照溶液的制备按处方中药材比例，取除五味子、连翘、女贞子外的其他药材，按其工艺制成不含五味子、连翘、女贞子的阴性制剂。再按2.1.3项下方法制备，即得阴性对照溶液。
2.1.5专属性考察分别将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按2.1.1项下方法进行测定，供试品溶液中五味子甲素、连翘苷、特女贞苷与其他组分色谱峰达到基线分离，且阴性对照溶液在与对照品相同保留时间处无色谱峰，因此可认为处方中其他药材与辅料对此3种成分的测定无干扰，色谱图见图1。
2.1.6线性关系考察精密吸取18.8mg·L-1的五味子甲素对照品储备液适量，用甲醇稀释得0.0376，1.504，3.008，6.016，7.52mg·L-1的系列对照品溶液，分别吸取上述溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程Y=43353X-5779.1，R2=0.9997，表明其在0.376～7.52mg·L-1线性关系良好。 (郑娟 程玲 沈成英 李娟娟 邱玲 沈刚 韩晋 袁海龙)