丹参含药血清对肝星状细胞Hh通路中SuFu和DYRK2表达的影响(1)
[摘要]观察丹参含药血清对瘦素刺激的大鼠肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSCs)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂(SuFu)和双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶2(DYRK2)表达的影响。清洁级SD大鼠(60只)给予丹参水煎剂、生理盐水、秋水仙碱，连续灌胃10d制备丹参含药血清。体外培养的肝星状细胞(HSCs)，除空白对照组外，其余各组均予瘦素100μg·L-1刺激24h，各组含药血清干预后置于37℃，5%CO2孵箱中培养。24h后收集细胞，采用MTT法检测HSCs的增殖，分别采用RT-PCR和Westernblot法测定SuFu和DYRK2的表达情况。用瘦素刺激大鼠HSCs后，DYRK2mRNA和蛋白表达均明显升高(与空白组比较P<0.01)，SuFumRNA和蛋白表达均明显降低(与空白组比较P<0.01或P<0.05)。抑制剂组(cyclopamine)、丹参含药血清、秋水仙碱组干预后，DYRK2mRNA和蛋白表达明显降低(与模型组比较P<0.01)，SuFumRNA蛋白表达均明显升高(与模型组比较P<0.01)。在模型组的基础上加入Hh通路激动剂(purmorphamine)充分活化后，DYRK2mRNA和蛋白表达均明显升高(与模型组比较P<0.01)，SuFumRNA和蛋白表达均明显降低(与模型组比较P<0.01)。用丹参含药血清干预激动剂组后，DYRK2mRNA和蛋白表达明显降低(与模型组比较P<0.01)，SuFumRNA和蛋白表达均明显升高(与模型组比较P<0.01)。丹参含药血清可通过干预瘦素诱导的HSCs中SuFu和DYRK2的表达，进而影响HSCs的活化增殖。
[关键词]丹参；HSCs；瘦素；SuFu；DYRK2；肝纤维化
肝纤维化是指肝细胞受到炎性刺激或发生坏死时，肝组织内胶原蛋白等细胞外基质(ECM)的增生与降解失去平衡，导致肝内纤维结缔组织异常增生的病理过程[1]。活化的肝星状细胞(HSCs)是肝纤维化过程中产生ECM的主要细胞。有研究发现，刺猬信号通路(Hh)在HSCs激活过程中起着重要的作用[2]。有学者在分析中医抗肝纤维化治疗的理法方药时发现：活血化瘀类中药使用率为各类药物之首。中药丹参在中医治疗肝纤维化中运用广泛，所占单味药物比例为7.7%。本实验以瘦素作为刺激因子，观察丹参含药血清对大鼠HSCs增殖及SuFu，DYRK2表达的影响，旨在进一步探讨丹参含药血清通过调控SuFu，DYRK2的表达抑制HSCs的活化增殖。
1材料
1.1动物SPF级SD大鼠60只(雌雄各半)，体重180～200g，购自重庆医科大学实验动物中心，动物许可证号SYXK(渝)2012-0001。实验大鼠在SPF级动物饲养室饲养。将60只大鼠随机平均分为空白组、丹参组、秋水仙碱组，每组20只，饲养10d后采取血清。
1.2细胞及药物大鼠肝星状细胞(HSC)购自重庆医科大学附属第二医院消化科(重庆医科大学附属第二医院消化内科实验室)；丹参购于重庆医科大学附属第一医院药房；秋水仙碱购于由西双版纳药业有限公司(国药准字H53021369)。
1.3试剂与器材瘦素购于PeproTech公司(产品编号400-21-1000)；兔抗鼠DYRK2(产品编号bs-12332R)，SuFu(产品编号bs-11209R)购自北京博奥森公司；二抗购自北京中杉公司(产品编号ZB-2301山羊抗兔IgG，ZB-2307goatRat)；Hedgehog通路激动剂(purmorphamine，编号S1146)、抑制剂(cyclopamine，编号S3042)购于Selleck公司；胰蛋白酶、RPMI1640培养液购于Hyclone公司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；青霉素-链霉素购自碧云天生物公司。TANKPRO纯水仪、CO2细胞培养箱(Thermo)，超净工作台(AIRTECH)，倒置相差显微镜(CXX41，Olympus)，HH-W600型恒温水浴锅(江苏荣华仪器制造有限公司)，METTLERTOLEDO电子精密天平，TGL-16台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，-80℃超低温冰箱(Haier)，高压灭菌锅(G154DWS)，6孔板、100mL细胞瓶(重庆海韵生物技术有限公司)。
2方法
2.1药物制备中药丹参按2010年版《中国药典》丹参的用量15g作为人的临床剂量，60kg成人每千克每天的量为15/60g。根据“动物与人体的每千克体重剂量折算系数表”，成人与大鼠的折算系数为6.25，换算成SD大鼠的剂量，丹参灌胃剂量为1.5625g·kg-1。以临床剂量作为低剂量组，2，4倍剂量作为中、高剂量组，本实验采用丹参高剂量进行灌胃则为6.25g·kg-1·d-1。
2.2药物血清制备清洁级SD大鼠60只，体重180～200g，随机平均分为3组，每组20只，空白组给予生理盐水10mL·kg-1·d-1，秋水仙碱组给予秋水仙碱0.1mg·kg-1·d-1，丹参高剂量组给予丹参高剂量水煎剂10mL·kg-1·d-1，每天灌胃1次，2～3mL/次，连续灌胃给药10d。最后一次给1～2h后乙醚麻醉，无菌条件下采用无添加剂真空采血管心脏采血。收集的血液经4℃冰箱静置过夜后离心吸取血清。收集的血清经56℃恒温水浴锅水浴灭活30min，用0.22μm微孔过滤器过滤除菌，分装至无菌1.5mLEP管，于-20℃冰箱储存备用。
2.3细胞培养大鼠肝星状细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃，5%CO2孵箱中培养，每天换液1次。倒置显微镜观察细胞生长状态，当细胞呈对数生长时，于超净台弃培养液，用无菌PBS液冲洗2遍，加入1mL的0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，收集细胞于10mL无菌离心管内离心，1000r·min-1，离心5min，弃上清，加入培养基吹打后以1传3方式进行传代。 (韩仕庆 王海兰 冯藜枥 曹文富)
[关键词]丹参；HSCs；瘦素；SuFu；DYRK2；肝纤维化
肝纤维化是指肝细胞受到炎性刺激或发生坏死时，肝组织内胶原蛋白等细胞外基质(ECM)的增生与降解失去平衡，导致肝内纤维结缔组织异常增生的病理过程[1]。活化的肝星状细胞(HSCs)是肝纤维化过程中产生ECM的主要细胞。有研究发现，刺猬信号通路(Hh)在HSCs激活过程中起着重要的作用[2]。有学者在分析中医抗肝纤维化治疗的理法方药时发现：活血化瘀类中药使用率为各类药物之首。中药丹参在中医治疗肝纤维化中运用广泛，所占单味药物比例为7.7%。本实验以瘦素作为刺激因子，观察丹参含药血清对大鼠HSCs增殖及SuFu，DYRK2表达的影响，旨在进一步探讨丹参含药血清通过调控SuFu，DYRK2的表达抑制HSCs的活化增殖。
1材料
1.1动物SPF级SD大鼠60只(雌雄各半)，体重180～200g，购自重庆医科大学实验动物中心，动物许可证号SYXK(渝)2012-0001。实验大鼠在SPF级动物饲养室饲养。将60只大鼠随机平均分为空白组、丹参组、秋水仙碱组，每组20只，饲养10d后采取血清。
1.2细胞及药物大鼠肝星状细胞(HSC)购自重庆医科大学附属第二医院消化科(重庆医科大学附属第二医院消化内科实验室)；丹参购于重庆医科大学附属第一医院药房；秋水仙碱购于由西双版纳药业有限公司(国药准字H53021369)。
1.3试剂与器材瘦素购于PeproTech公司(产品编号400-21-1000)；兔抗鼠DYRK2(产品编号bs-12332R)，SuFu(产品编号bs-11209R)购自北京博奥森公司；二抗购自北京中杉公司(产品编号ZB-2301山羊抗兔IgG，ZB-2307goatRat)；Hedgehog通路激动剂(purmorphamine，编号S1146)、抑制剂(cyclopamine，编号S3042)购于Selleck公司；胰蛋白酶、RPMI1640培养液购于Hyclone公司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；青霉素-链霉素购自碧云天生物公司。TANKPRO纯水仪、CO2细胞培养箱(Thermo)，超净工作台(AIRTECH)，倒置相差显微镜(CXX41，Olympus)，HH-W600型恒温水浴锅(江苏荣华仪器制造有限公司)，METTLERTOLEDO电子精密天平，TGL-16台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，-80℃超低温冰箱(Haier)，高压灭菌锅(G154DWS)，6孔板、100mL细胞瓶(重庆海韵生物技术有限公司)。
2方法
2.1药物制备中药丹参按2010年版《中国药典》丹参的用量15g作为人的临床剂量，60kg成人每千克每天的量为15/60g。根据“动物与人体的每千克体重剂量折算系数表”，成人与大鼠的折算系数为6.25，换算成SD大鼠的剂量，丹参灌胃剂量为1.5625g·kg-1。以临床剂量作为低剂量组，2，4倍剂量作为中、高剂量组，本实验采用丹参高剂量进行灌胃则为6.25g·kg-1·d-1。
2.2药物血清制备清洁级SD大鼠60只，体重180～200g，随机平均分为3组，每组20只，空白组给予生理盐水10mL·kg-1·d-1，秋水仙碱组给予秋水仙碱0.1mg·kg-1·d-1，丹参高剂量组给予丹参高剂量水煎剂10mL·kg-1·d-1，每天灌胃1次，2～3mL/次，连续灌胃给药10d。最后一次给1～2h后乙醚麻醉，无菌条件下采用无添加剂真空采血管心脏采血。收集的血液经4℃冰箱静置过夜后离心吸取血清。收集的血清经56℃恒温水浴锅水浴灭活30min，用0.22μm微孔过滤器过滤除菌，分装至无菌1.5mLEP管，于-20℃冰箱储存备用。
2.3细胞培养大鼠肝星状细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃，5%CO2孵箱中培养，每天换液1次。倒置显微镜观察细胞生长状态，当细胞呈对数生长时，于超净台弃培养液，用无菌PBS液冲洗2遍，加入1mL的0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，收集细胞于10mL无菌离心管内离心，1000r·min-1，离心5min，弃上清，加入培养基吹打后以1传3方式进行传代。 (韩仕庆 王海兰 冯藜枥 曹文富)