茶病灵芝中三萜类成分研究(1)
[摘要]研究茶病灵芝Ganoderma theaecolum的三萜类成分。茶病灵芝乙醇提取物经硅胶、ODS和PreHPLC等色谱技术分离纯化，通过波谱学方法鉴定化合物的结构。从茶病灵芝中分离得到15个三萜类化合物，分别为赤芝酮C(1)，赤芝酮D(2)，7羰基灵芝酸Z2(3)，7羰基灵芝酸Z(4)，灵芝烯酸H(5)，灵芝烯酸B(6)，3β，7β二羟基11，15，23三羰基羊毛甾8，16二烯26酸(7)，3β，7β二羟基11，15，23三羰基羊毛甾8，16二烯26酸甲酯(8)，ganolucidic acid B(9)，ganolucidate F(10)，灵芝酸C2甲酯(11)，灵芝酸ζ(12)，灵芝酸AP3(13)，灵芝酸B甲酯(14)，灵芝醇B(15)。化合物1～15均为首次从该真菌中分离得到。
[关键词]灵芝属；茶病灵芝；三萜类
我国灵芝属真菌有98种，《中国药典》2015年版记载灵芝基原种为赤芝Ganoderma lucidum (Leyssex Fr.)Karst.或紫芝Granoderma sinense Zhao Xu et Zhang的干燥子实体。茶病灵芝G theaecolum为灵芝科灵芝属真菌，主要产于海南，民间作为灵芝使用，经查阅文献，除本课题组2014年发表了一篇有关茶病灵芝化学成分的文章外，茶病灵芝的化学成分和药理作用均未有过报道。现代科学研究证明，灵芝属主要化学成分为多糖类、三萜及甾体类、生物碱类、腺苷类、蛋白质、多肽、氨基酸类化合物，具有抗肿瘤、保肝护肝、抗氧化、抗衰老作用；心脏保护作用；改善记忆作用；抗病毒、抑制细菌作用等。灵芝三萜类化合物有抑制组胺释放[12]、抗HIV1病毒及抗HIV1蛋白酶活性[34]、抑制肿瘤细胞生长[5]等作用。
本实验前期对茶病灵芝乙醇提取物进行了生物活性筛选，其中正丁醇部位具有较强的蛋白酪氨酸激酶抑制活性，在100 mg·L-1时，抑制率达到88%，对乙醇提取物进行了系统的化学成分研究，得到了5个新的三萜类化合物，5个已知化合物，药理活性筛选结果显示其中6个化合物对DL半乳糖胺诱导的HL7702肝细胞损伤具有一定的保护作用[6]。本文继续报道从茶病灵芝乙醇提取物上大孔树脂的50%乙醇洗脱部位和70%乙醇洗脱部位分离得到的15个三萜类化合物，分别鉴定为赤芝酮C(1)，赤芝酮D(2)，7羰基灵芝酸Z2(3)，7羰基灵芝酸Z(4)，灵芝烯酸H(5)，灵芝烯酸B(6)，3β，7β二羟基11，15，23三羰基羊毛甾8，16二烯26酸(7)，3β，7β二羟基11，15，23三羰基羊毛甾8，16二烯26酸甲酯(8)，ganolucidic acid B(9)，ganolucidate F(10)，灵芝酸C2甲酯(11)，灵芝酸ζ(12)，灵芝酸AP3(13)，灵芝酸B甲酯(14)，灵芝醇B(15)。化合物1～15均为首次从该真菌中分离得到。
1材料
VNS600，Bruker400，BrukerAV500核磁共振仪测定NMR谱；Agilent 1100 系列 LC/MSD TrapSL型液质联用仪测定ESIMS；Agilent高效液相色谱仪，YMC C18(20 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；LC 3000型中压色谱仪；反相柱色谱硅胶RP18(50 μm)为YMC公司生产；薄层色谱硅胶GF254及柱色谱硅胶(200～300目)为青岛海洋化工厂生产；葡聚糖凝胶 SephadexLH 20 为GE Pharmacia 公司生产；所用试剂均为分析纯或色谱纯。
茶病灵芝于2012年7月采于海南五指山市，由中国科学院微生物研究所张小青研究员鉴定为茶病灵芝G theaecolum，凭证标本(NoS2421 )保存于中国医学科学院药物研究所标本室。
2提取与分离
20 kg茶病灵芝子实体粉碎后，用95%乙醇加热回流提取，减压浓缩至干，得到浸膏1 kg。浸膏经D101大孔树脂，乙醇水梯度洗脱后得到50%乙醇部分360 g，70%乙醇部分110 g。50%乙醇部分通过硅胶柱色谱分离，采用氯仿甲醇梯度(100∶1～1∶1)洗脱，得到FrsA～J共10个部分。其中FrB部分(10 g)经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮梯度(9∶1～1∶1)洗脱，Frs1～25共25个流分。FrB8经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(4∶1)洗脱，得到化合物2(45 mg)。FrB9经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(7∶3)洗脱，得到化合物7(25 mg)，FrB25经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(6∶4)洗脱，得到化合物8(10 mg)。FrC部分(35 g)经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮梯度(9∶1～1∶1)洗脱，Frs1～36共36个流分。FrC5经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(9∶1)洗脱，得到化合物1(4 mg)，5(56 mg)，FrC9经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(4∶1)洗脱，得到化合物11(3 mg)，9(2 mg)，10(5 mg)，FrC21经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(6∶4)洗脱，得到化合物6(2 mg)，13(15 mg)。FrD部分(84 g)经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇梯度(30∶1～1∶1)洗脱，Frs1～55共55个流分。FrD11经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(2∶1)洗脱，得到化合物14 (1 mg)，FrD32经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇等度(9∶1)洗脱，得到化合物12(2 mg)。70%乙醇部分通过硅胶柱色谱分离，用氯仿甲醇梯度(20∶1～1∶1)洗脱，得到FrsA～G共10个部分。其中FrA部分(21 g)经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇梯度(10∶1～1∶1)洗脱，Frs1～10共10个流分。FrA2经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇等度(10∶1)洗脱，得到化合物3(135 mg)，FrA8经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇等度(7∶3)洗脱，得到化合物4(210 mg)，FrE部分(15 g)经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇梯度(7∶3～1∶1)洗脱，Frs1～8共8个流分。FrE7经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇等度(6∶4)洗脱，得到化合物15(5 mg)。 (刘莉莹康洁吴长辉李晔陈若芸)
[关键词]灵芝属；茶病灵芝；三萜类
我国灵芝属真菌有98种，《中国药典》2015年版记载灵芝基原种为赤芝Ganoderma lucidum (Leyssex Fr.)Karst.或紫芝Granoderma sinense Zhao Xu et Zhang的干燥子实体。茶病灵芝G theaecolum为灵芝科灵芝属真菌，主要产于海南，民间作为灵芝使用，经查阅文献，除本课题组2014年发表了一篇有关茶病灵芝化学成分的文章外，茶病灵芝的化学成分和药理作用均未有过报道。现代科学研究证明，灵芝属主要化学成分为多糖类、三萜及甾体类、生物碱类、腺苷类、蛋白质、多肽、氨基酸类化合物，具有抗肿瘤、保肝护肝、抗氧化、抗衰老作用；心脏保护作用；改善记忆作用；抗病毒、抑制细菌作用等。灵芝三萜类化合物有抑制组胺释放[12]、抗HIV1病毒及抗HIV1蛋白酶活性[34]、抑制肿瘤细胞生长[5]等作用。
本实验前期对茶病灵芝乙醇提取物进行了生物活性筛选，其中正丁醇部位具有较强的蛋白酪氨酸激酶抑制活性，在100 mg·L-1时，抑制率达到88%，对乙醇提取物进行了系统的化学成分研究，得到了5个新的三萜类化合物，5个已知化合物，药理活性筛选结果显示其中6个化合物对DL半乳糖胺诱导的HL7702肝细胞损伤具有一定的保护作用[6]。本文继续报道从茶病灵芝乙醇提取物上大孔树脂的50%乙醇洗脱部位和70%乙醇洗脱部位分离得到的15个三萜类化合物，分别鉴定为赤芝酮C(1)，赤芝酮D(2)，7羰基灵芝酸Z2(3)，7羰基灵芝酸Z(4)，灵芝烯酸H(5)，灵芝烯酸B(6)，3β，7β二羟基11，15，23三羰基羊毛甾8，16二烯26酸(7)，3β，7β二羟基11，15，23三羰基羊毛甾8，16二烯26酸甲酯(8)，ganolucidic acid B(9)，ganolucidate F(10)，灵芝酸C2甲酯(11)，灵芝酸ζ(12)，灵芝酸AP3(13)，灵芝酸B甲酯(14)，灵芝醇B(15)。化合物1～15均为首次从该真菌中分离得到。
1材料
VNS600，Bruker400，BrukerAV500核磁共振仪测定NMR谱；Agilent 1100 系列 LC/MSD TrapSL型液质联用仪测定ESIMS；Agilent高效液相色谱仪，YMC C18(20 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；LC 3000型中压色谱仪；反相柱色谱硅胶RP18(50 μm)为YMC公司生产；薄层色谱硅胶GF254及柱色谱硅胶(200～300目)为青岛海洋化工厂生产；葡聚糖凝胶 SephadexLH 20 为GE Pharmacia 公司生产；所用试剂均为分析纯或色谱纯。
茶病灵芝于2012年7月采于海南五指山市，由中国科学院微生物研究所张小青研究员鉴定为茶病灵芝G theaecolum，凭证标本(NoS2421 )保存于中国医学科学院药物研究所标本室。
2提取与分离
20 kg茶病灵芝子实体粉碎后，用95%乙醇加热回流提取，减压浓缩至干，得到浸膏1 kg。浸膏经D101大孔树脂，乙醇水梯度洗脱后得到50%乙醇部分360 g，70%乙醇部分110 g。50%乙醇部分通过硅胶柱色谱分离，采用氯仿甲醇梯度(100∶1～1∶1)洗脱，得到FrsA～J共10个部分。其中FrB部分(10 g)经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮梯度(9∶1～1∶1)洗脱，Frs1～25共25个流分。FrB8经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(4∶1)洗脱，得到化合物2(45 mg)。FrB9经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(7∶3)洗脱，得到化合物7(25 mg)，FrB25经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(6∶4)洗脱，得到化合物8(10 mg)。FrC部分(35 g)经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮梯度(9∶1～1∶1)洗脱，Frs1～36共36个流分。FrC5经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(9∶1)洗脱，得到化合物1(4 mg)，5(56 mg)，FrC9经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(4∶1)洗脱，得到化合物11(3 mg)，9(2 mg)，10(5 mg)，FrC21经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(6∶4)洗脱，得到化合物6(2 mg)，13(15 mg)。FrD部分(84 g)经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇梯度(30∶1～1∶1)洗脱，Frs1～55共55个流分。FrD11经硅胶柱色谱，用石油醚丙酮等度(2∶1)洗脱，得到化合物14 (1 mg)，FrD32经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇等度(9∶1)洗脱，得到化合物12(2 mg)。70%乙醇部分通过硅胶柱色谱分离，用氯仿甲醇梯度(20∶1～1∶1)洗脱，得到FrsA～G共10个部分。其中FrA部分(21 g)经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇梯度(10∶1～1∶1)洗脱，Frs1～10共10个流分。FrA2经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇等度(10∶1)洗脱，得到化合物3(135 mg)，FrA8经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇等度(7∶3)洗脱，得到化合物4(210 mg)，FrE部分(15 g)经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇梯度(7∶3～1∶1)洗脱，Frs1～8共8个流分。FrE7经硅胶柱色谱，用氯仿甲醇等度(6∶4)洗脱，得到化合物15(5 mg)。 (刘莉莹康洁吴长辉李晔陈若芸)