三七几丁质酶基因PnCHI1的克隆及表达特性分析(3)

http://www.100md.com 2016年6月1日 《中国中药杂志》2016年第11期

     2.2 RNA提取及mRNA分离 采用TRIGene总RNA提取试剂盒(GenStar Biosolutions)提取各处理样品中的总RNA。取适量上述各样品总RNA，从各样品总RNA中取等量混匀，并按照NucleoTrap mRNA Midi Kit (Macherey-Nagel， Germany)说明书从总RNA中分离mRNA，并以分离的mRNA为模板逆转录合成RACE模板(Clontech， USA)。

    2.3 5′-RACE和3′-RACE 根据三七转录组测序产生的PnCHI1 EST序列，设计5′-RACE和3′-RACE特异性引物。5′-RACE特异性引物为5′-ATCCAGTACCACAAGGCTGTCTTGAAGG-3′，3′-RACE特异性引物为5′-CATGTTACGCACCACCACCGCAA-3′。RACE-PCR产物经TA克隆连接pGEM-T (Promega， USA)载体上，再将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆测序 ......