天然产物合成生物学关键技术(3)

http://www.100md.com 2016年11月15日 《中国中药杂志》2016年第22期

     1.3.4 Gibson组装 Gibson组装要求将多个具有重复序列的DNA片段和线性化的载体混合，同时加入3个酶的混合物，分别为：T5核酸外切酶(使所有DNA片段产生一个3′的悬突，重叠的部分自动退火)、Phusion聚合酶(填补和连接缝隙)和Taq连接酶(修复裂痕，产生完整的目标产物)[34]。Gibson等运用此方法2 d内可将75个284 bp的DNA片段组装成整个的老鼠线粒体基因组(16.3 kb)[35]。Gibson组装方法不仅可实现无缝拼接，而且组装尺度也十分可观，不仅适用于以寡核苷酸链为起始的DNA合成，也适用于构建长的DNA片段，甚至是基因组[36]。该法具有快速、简便、易行等特点，但因其中酶的造价较高，在大规模使用时，不得不考虑成本。T5核酸外切酶可以完全破坏<250 bp的DNA片段，所以组装的片段长度需>250 bp。如果片段长度<250 bp可以在Gibson组装之前使用重叠延伸PCR等技术使其长度达到要求[37]。

    1.4 基于体内同源重组的组装

    为了组装得到更长的DNA序列 ......