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编号:12979978
血塞通注射液对体外OGD/R损伤的BV2细胞炎症反应的影响(1)
http://www.100md.com 2017年1月1日 《中国中药杂志》 2017年第1期
     [摘要]该研究通过对小鼠神经小胶质细胞(BV2)体外模拟脑缺血再灌注(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)损伤探讨血塞通注射液(XST)抗炎症反应的作用及可能的作用机制。BV2细胞OGD损伤4 h后,通过测定细胞存活率(MTS法)确定复氧时间及血塞通给药浓度,采用ELISA法检测细胞上清中炎症因子TNFα,IL1β,IL6及IL10的分泌水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测细胞中pERK,pJNK,pp38蛋白表达水平的变化,免疫荧光法检测NFκB p65的核转位水平。结果显示XST 25 mg·L-1可显著提高OGD 4 h/R 6 h引起的细胞活力的下降,并抑制TNFα,IL1β,IL6及IL10的分泌水平的增高,同时XST能下调OGD/R诱导的pJNK,pp38蛋白表达的升高,并逆转NFκB p65的核转位。以上研究结果表明 XST对OGD/R损伤的BV2细胞炎症反应具有显著的抑制作用,其作用机制可能与抑制前炎症因子的分泌,调节MAPK信号通路及核转录因子NFκB p65有关。
, 百拇医药
    [关键词]血塞通注射液; 体外模拟脑缺血再灌注; 炎症因子; MAPK; NFκB p65

    缺血性脑卒中是常见多发的神经系统性疾病,约占脑卒中的60%~80%[1],是世界范围内危害人类健康的重要疾病之一。已有研究表明,小胶质细胞激活后的炎症反应和免疫应答参与介导缺血性脑卒中的脑损伤过程[2]。小胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中参与免疫应答的主要细胞类型,约占所有神经胶质细胞的5%~20%[3]。激活的小胶质细胞通过分泌释放TNFα,IL1β,IL6,IL10等促炎因子以及NO,ROS等细胞毒性因子造成CNS神经元损伤[4]。血塞通注射液(Xuesaitong injection,XST)含三七总皂苷,三七长于止血、活血、消肿止痛,药理研究表明,三七有增加冠状动脉血流量、扩张血管、降低动脉血压、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、降低血黏度等作用。实验研究也表明,三七总皂苷制剂具有通利血脉、祛瘀化滞之功,能保护神经细胞,促进吞噬细胞的吞噬功能以及胶质细胞的修复功能,对脑梗死有确切的治疗作用[57]。本研究采用BV2细胞体外模拟脑缺血再灌注损伤,考察XST对体外OGD/R诱导BV2神经小胶质细胞炎症反应及相关的信号通路的影响,阐明XST抗炎的分子机制。
, 百拇医药
    1材料

    11细胞株BV2细胞购自中国科学院昆明动物研究所细胞库,细胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基加青霉素100 U·mL-1、链霉素100 mg·L-1,置37 ℃,5%CO2的培养箱内培养,每隔24 h换1 次培养液,48 h传代1次。

    12药物与试剂血塞通注射液(XST,云南白药集团股份有限公司,批号XBl2002);金纳多注射液(JND,批号H6138);DMEM高糖培养基、DMEM无糖培养基及胎牛血清(Gibco公司);青链霉素混合液(100×)(Biotopped公司);胰蛋白酶(Amresco公司);MTS试剂盒(Promega公司);蛋白质提取试剂盒(QiaGen公司);肿瘤坏死因子(TNFα)、炎症因子IL1β,IL6,IL10 ELISA试剂盒(eBioscience公司);抗体:GAPDH Rabbit mAb,p38 MAPK Antibody,Phosphop38 MAPK (Thr180/Tyr182) Rabbit mAb,SAPK/JNK(56G8) Rabbit mAb,PhosphoSAPK/JNK (Thr183/Tyr185) Rabbit mAb,p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody,Phosphop44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Antibody,NFκB p65 Rabbit mAb,PhosphoNFκB p65(Ser536) Rabbit mAb(CST公司)。
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    13仪器CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司;Eppendorf 5810R型高速冷冻多用途离心机(德国);缺氧小室购自加拿大Stemcell公司;微孔板检测系统Flex Station 3购自美国MD公司;ChemiDoc XRS系统购自美国Biorad公司;Leica DMI 4000B荧光倒置显微镜购于德国徕卡公司。

    2方法

    21体外模拟脑缺血再灌注(OGD/R)模型的建立体外模拟脑缺血再灌注(OGD/R)模型的建立参考文献方法并根据本实验结果略作改动[8]。细胞按一定密度接种于96孔板或6孔板中,培养24 h后,弃上清,用无糖、无血清的DMEM培养基更换,置于缺氧小室中,用95%氮气、5%CO2混合气体连续通气20 min,控制进气流量为20 L·min-1。随后,将出气阀夹紧并将小室置于37 ℃CO2培养箱中继续培养4 h。缺氧4 h后,氧糖剥夺试验结束,将细胞置于二氧化塘培养箱中常规培养(37 ℃,95%空气,5%CO2),复氧同时分别给予血塞通及金纳多注射液处理细胞,按照不同试验需要复氧培养一定时间。
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    22细胞活力测定将BV2细胞以15×104个/100 μL/孔的密度接种至96孔板中,OGD 4 h后加入不同浓度的血塞通注射液(625,125,25,50,100 mg·L-1),分别复氧15,3,6,12 h,复氧结束后,采用MTS试剂盒检测细胞活力,按说明书加入20 μL MTS,继续在培养箱中孵育4 h后,于490 nm处测定各组吸光度A490。

    23酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎症因子表达将BV2细胞以15×104个/100 μL/孔的密度接种至96孔板中,按照OGD 4 h/R 6 h执行体外氧糖剥夺试验,复氧同时给药,复氧3 h后分别收集各组细胞上清液-80 ℃保存,按照ELISA试剂盒说明书测定各组细胞上清液中腫瘤坏死因子(TNFα)、炎症因子IL1β,IL6和IL10水平。, http://www.100md.com(洪倩 王实 陈昌秀 掌瑜 王阳 樊媛 马增春)
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