多穗柯转录组分析及黄酮类化合物合成相关基因的挖掘(1)
[摘要] 多穗柯具有甜味和保健功效，其中黄酮类化物是主要活性物质。为获取多穗柯转录组数据库以及黄酮类化合物生物合成相关基因，该研究用RNA-Seq中的Illumina HiSeq 4000对多穗柯嫩叶进行转录组测序，共获得6 Gb数据，拼接后得到41 043条Unigene，与7个基因数据库进行比对，可归类于51个GO分类中，涉及到237个KEGG标准代谢通路。找到黄酮合成相关基因28条。通过MicroSatallite(MISA)软件分析筛选到18 161个SSR，其中单碱基重复最丰富，有7 346个。此研究得到大量转录本信息，为多穗柯的分子生物学研究提供了宝贵的转录组数据库资源。
[关键词] 多穗柯； 转录组； 高通量测序； 黄酮类化合物
[Abstract] The sweet taste and health effect of Lithocarpus polystachyus are mainly related flavonoid. To obtain Lithocarpus transcriptome database and flavonoid biosynthesis-related genes， the RNA-Seq techology (Illumina HiSeq 4000) was used to sequence its transcriptome. Six Gb database was assembled after assembly steps， and 41 043 of L. polystachyus unigenes were obtained. With blasting them with 7 data banks， all unigenes were involved in 51 GO-terms and 237 metabolic pathways. And furthermore 28 genes of the flavonoid biosynthesis-related were found. After using the MicroSatallite， 18 161 SSR were obtained， the single-nucleotide-repeated was the richest at 7 346. These data represent abundant messages about transcripts and provide valuable genome data sources in molecular biology of L. polystachyus.
, 百拇医药
[Key words] Lithocarpus polystachyus； transcriptome； high-throughput sequencing； flavonoids
多穗柯Lithocarpus polystachyrus Rehd，别名甜茶，是壳斗科石柯属常绿乔木[1]。因其具有强烈的甜味和保健功能而被广泛关注，其中二氢查耳酮类化合物根皮苷和三叶苷是其主要活性物质，具有降血糖、保肝、抗氧化、抗肿瘤等生物活性[2]。三叶苷的含量在多穗柯二氢查二酮苷类中最高，占95%，且根皮苷和三叶苷互为异构体。目前，仅有根皮苷受到较高关注，它的合成途径[3]、作用[4]等都已有相关报道，但是关于多穗柯中根皮苷和三叶苷的合成、代谢以及它们相互转化的途径尚不够明确。因此，利用转录组测序技术，对多穗柯转录组进行分析，找出黄酮类化合物合成相关基因，为后续对根皮苷和三叶苷的研究提供资源。
转录组是指特定生物体在某种状态下所有基因转录产物的总和，转录组研究属于功能基因组学研究的范畴，是连接基因组与蛋白质组的纽带[5]。它能反映生物个体在特定器官、组织或某一特定发育、生理阶段细胞中所有基因表达水平的数据。可用来比较不同组织或生理状况下基因表达水平差异，发现与特定生理功能相关的基因，推测未知基因[6]。因此，采用转录组测序技术，对多穗柯转录组进行测序分析，建立起转录组数据库，为多穗柯中黄酮类化合物二氢查耳酮类的根皮苷和三叶苷生物合成研究打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 cDNA制备
以多穗柯嫩叶为本研究原材料提取植物总RNA，再逆转录为cDNA，用于构建转录组数据库。植物总RNA 提取试剂盒和逆转录试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 转录组数据的组装与分析
1.2.1 组装 采用Illumina HiSeq 4000测序技术平台的PE150技术进行测序，将得到的Raw Data进行过滤处理，获得高质量的Clean Reads，使用trinity软件进行组装，得到Unigene。
1.2.2 功能预测 利用BlastX将All-Unigene与nr[7]，Swiss-Prot[8]，GO[9]，KOG[10]，KEGG[11]等6个数据库进行比对。又使用KOBAS2.0[12]去获取序列在KEGG中比对KEGG Orthology结果，预测出序列的氨基酸序列之后，使用HMMER[13]软件与Pfam[14]数据库比对，获得注释信息。
, 百拇医药
1.2.3 黄酮类化合物合成相关基因的挖掘 根据康亚兰[15]和郭欣慰[16]提出的黄酮类化合物合成途径中的结构基因与调节基因，以及KEGG注释的结果和数据库中已知的基因信息，利用本地Blast進行检索比对，确定本转录组数据中与黄酮合成相关的基因。
1.2.4 SSR分析 微卫星序列(microsatellite DNA)又称为简单序列重复(simple sequence repeats，SSR) 或简单序列(simple sequences)，是指以1～6个核苷酸为基本重复单位的串联重复序列，其长度大多在 100 bp 以内。它们广泛存在于各类真核生物基因组中，原核生物基因组中也含有少量的微卫星序列[17]。SSR作为分子标记的一种，被广发用于杂交育种、种群遗传多样性、遗传连锁图谱的构建等研究领域。目前关于多穗柯的分子标记十分有限，本研究利用MicroSatallite(MISA)软件找出全部的SSR，为多穗柯的遗传标记研究提供非常重要物质资源和依据。, 百拇医药(宋菊 黄剑 李志栋 龙月红 邢朝斌)
[关键词] 多穗柯； 转录组； 高通量测序； 黄酮类化合物
[Abstract] The sweet taste and health effect of Lithocarpus polystachyus are mainly related flavonoid. To obtain Lithocarpus transcriptome database and flavonoid biosynthesis-related genes， the RNA-Seq techology (Illumina HiSeq 4000) was used to sequence its transcriptome. Six Gb database was assembled after assembly steps， and 41 043 of L. polystachyus unigenes were obtained. With blasting them with 7 data banks， all unigenes were involved in 51 GO-terms and 237 metabolic pathways. And furthermore 28 genes of the flavonoid biosynthesis-related were found. After using the MicroSatallite， 18 161 SSR were obtained， the single-nucleotide-repeated was the richest at 7 346. These data represent abundant messages about transcripts and provide valuable genome data sources in molecular biology of L. polystachyus.
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[Key words] Lithocarpus polystachyus； transcriptome； high-throughput sequencing； flavonoids
多穗柯Lithocarpus polystachyrus Rehd，别名甜茶，是壳斗科石柯属常绿乔木[1]。因其具有强烈的甜味和保健功能而被广泛关注，其中二氢查耳酮类化合物根皮苷和三叶苷是其主要活性物质，具有降血糖、保肝、抗氧化、抗肿瘤等生物活性[2]。三叶苷的含量在多穗柯二氢查二酮苷类中最高，占95%，且根皮苷和三叶苷互为异构体。目前，仅有根皮苷受到较高关注，它的合成途径[3]、作用[4]等都已有相关报道，但是关于多穗柯中根皮苷和三叶苷的合成、代谢以及它们相互转化的途径尚不够明确。因此，利用转录组测序技术，对多穗柯转录组进行分析，找出黄酮类化合物合成相关基因，为后续对根皮苷和三叶苷的研究提供资源。
转录组是指特定生物体在某种状态下所有基因转录产物的总和，转录组研究属于功能基因组学研究的范畴，是连接基因组与蛋白质组的纽带[5]。它能反映生物个体在特定器官、组织或某一特定发育、生理阶段细胞中所有基因表达水平的数据。可用来比较不同组织或生理状况下基因表达水平差异，发现与特定生理功能相关的基因，推测未知基因[6]。因此，采用转录组测序技术，对多穗柯转录组进行测序分析，建立起转录组数据库，为多穗柯中黄酮类化合物二氢查耳酮类的根皮苷和三叶苷生物合成研究打下基础。
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1 材料与方法
1.1 cDNA制备
以多穗柯嫩叶为本研究原材料提取植物总RNA，再逆转录为cDNA，用于构建转录组数据库。植物总RNA 提取试剂盒和逆转录试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 转录组数据的组装与分析
1.2.1 组装 采用Illumina HiSeq 4000测序技术平台的PE150技术进行测序，将得到的Raw Data进行过滤处理，获得高质量的Clean Reads，使用trinity软件进行组装，得到Unigene。
1.2.2 功能预测 利用BlastX将All-Unigene与nr[7]，Swiss-Prot[8]，GO[9]，KOG[10]，KEGG[11]等6个数据库进行比对。又使用KOBAS2.0[12]去获取序列在KEGG中比对KEGG Orthology结果，预测出序列的氨基酸序列之后，使用HMMER[13]软件与Pfam[14]数据库比对，获得注释信息。
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1.2.3 黄酮类化合物合成相关基因的挖掘 根据康亚兰[15]和郭欣慰[16]提出的黄酮类化合物合成途径中的结构基因与调节基因，以及KEGG注释的结果和数据库中已知的基因信息，利用本地Blast進行检索比对，确定本转录组数据中与黄酮合成相关的基因。
1.2.4 SSR分析 微卫星序列(microsatellite DNA)又称为简单序列重复(simple sequence repeats，SSR) 或简单序列(simple sequences)，是指以1～6个核苷酸为基本重复单位的串联重复序列，其长度大多在 100 bp 以内。它们广泛存在于各类真核生物基因组中，原核生物基因组中也含有少量的微卫星序列[17]。SSR作为分子标记的一种，被广发用于杂交育种、种群遗传多样性、遗传连锁图谱的构建等研究领域。目前关于多穗柯的分子标记十分有限，本研究利用MicroSatallite(MISA)软件找出全部的SSR，为多穗柯的遗传标记研究提供非常重要物质资源和依据。, 百拇医药(宋菊 黄剑 李志栋 龙月红 邢朝斌)