玄参内生真菌分离、鉴定及系统发育分析(1)
[摘要]分别从武隆产区玄参根、主茎、侧枝、叶片和重庆市区栽培玄参侧枝中分离内生真菌，根据形态学特征和26SrDNA D1/D2测序结果对其进行鉴定，并进行了种群多样性分析，对优势属炭疽菌属内生真菌构建了系统发育树。试验结果显示：真菌种群多样性指数，武隆玄参叶片>主茎=侧枝>根，重庆玄参侧枝>武隆玄参侧枝。共计分离得到内生真菌58株，绝大部分是各种植物病原菌，其优势属为刺盘孢属Colletotrichum，其中绝大多数是C. gloeosporioides和C. boninense。叶片和子芽可能是内生菌侵染的主要途径；内生菌和病原菌可能相互转化，受环境、基因型等多种因素影响。
[关键词] 玄参； 内生真菌； 鉴定； 系统发育分析
[Abstract] The endophytic fungi from root， main stem， branch and leaf of Scrophularia ningpoensis were isolated and identified from Wulong and Chongqing， and the population diversity analysis and phylogenetic analysis were followed. The result indicated that， as to population diversity index， S. ningpoensis from Wulong： leaf>main stem = branch>root， branch from Chongqing>branch from Wulong. Fifty-eight endophytic fungi were obtained， most of which were the pathogens of the plant. Colletotrichum was the prevailing genus， of which C. gloeosporioides and C. boninense were the prevailing strains. Leaf and seedlings might be the main path of infection. Endophytic fungi and pathogen might convert to each other， influenced by such factors as environment， genotype et al.
, 百拇医药
[Key word] Scrophularia ningpoensis； endophytic fungi； identification； phylogenetic analysis
玄參为玄参科玄参属植物玄参Scrophularia ningpoensis的干燥根，始载于《神农本草经》，性微寒，味甘、苦、咸，具有凉血滋阴、泻火解毒的功效，主治热病伤阴诸证，如骨蒸、痨咳、津伤便秘、温毒发斑，及目赤、咽痛、臃肿等[1]。玄参是我国大宗药材品种，市场需求巨大。目前玄参栽培以施用化肥为主，多年连续施用影响药材品质，损害土壤肥力，破坏生态环境。而很多植物内生菌对宿主具有明显的促生作用。内生菌(endophyte) 广泛存在于植物各器官、组织细胞内及细胞间隙，其种类随宿主植物种类、植株器官、地域、季节气候而变化，具有丰富的多样性，国内外相关研究报道很多[2-5]。有研究表明，内生菌及其代谢产物具有拮抗、促生长、抗肿瘤等多种活性，可广泛应用于农业、工业、医药领域[6-9]。玄参内生菌方面的研究极少，仅见文献报道了玄参块根内生菌产哈巴俄苷的相关研究，且未明确鉴定出内生菌的种类[10]。本研究对玄参内生真菌进行了分离和鉴定，并对优势属炭疽菌属内生真菌进行了系统发育分析，旨在为筛选对玄参具有促生长作用的内生真菌，研发微生物肥料，减少化肥施用奠定基础。同时也揭示了玄参内生真菌的分布规律，为进一步研究玄参化学成分与内生菌的相关性，筛选活性物质提供前期基础。
, http://www.100md.com
1 材料
1.1 试验材料采集
2015年8月，在玄参生长盛期，分别采取重庆市中药研究院植物园(以下简称植物园，海拔400 m，北纬29.35°，东经106.33°)人工栽培玄参的侧枝和重庆武隆仙女山杨柳村玄参基地(海拔1 350 m，北纬 29.43°，东经 107.77°)人工栽培玄参全株(叶、主茎、侧枝、根)，采回后立即进行内生真菌分离。
1.2 试剂与仪器
Takara9164和RR178试剂盒购自宝生物公司。DYY-6C水平电泳仪，PTC-100 型 PCR仪，Gel Doc XR凝胶成像仪。
1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200 g，切碎块，煮汁过滤，加葡萄糖20 g，琼脂粉7 g，定容至1 L。
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2 方法
2.1 内生真菌分离与纯化
植物园栽培玄参植株上部、中部、下部健壮无病虫害侧枝各取3～5枝，全部混合后剪3 cm长小段。仙女山玄参植株分解为块根、主茎、侧枝、叶片。块根洗去泥土，轻轻刮去表面薄皮，洗净，切小块；植株主茎上部、中部、下部各取一段(约15～20 cm长)后混合，剪3 cm长小段；植株上部、中部、下部健壮无病虫害侧枝各取3～5枝，全部混合后剪3 cm长小段；植株上部、中部、下部健壮无病虫害叶片各取4～6片后全部混合，剪3～4 cm2小块。以上材料用洗衣粉水洗涤2 min，流水冲洗40 min，75%乙醇洗涤1 min，0.1%升汞消毒5 min，无菌水洗涤4次，取最后一次洗涤的洗液数滴于PDA涂布，共接种3皿，作为对照。材料用无菌滤纸吸干后，再次将根块分为1 cm2小薄片，茎段剪0.5～1 cm长小段，叶片切0.5～1 cm2小片，接种PDA。对照和材料均置于25 ℃培养箱，黑暗，培养5～10 d后，挑取组织周围长出的菌丝转接入 PDA平板中纯化，直到得到纯净无污染的菌落。, 百拇医药(伍晓丽 宋旭红 杨宏国 刘飞 张雪 刘金亮 陈大霞 李隆云)
[关键词] 玄参； 内生真菌； 鉴定； 系统发育分析
[Abstract] The endophytic fungi from root， main stem， branch and leaf of Scrophularia ningpoensis were isolated and identified from Wulong and Chongqing， and the population diversity analysis and phylogenetic analysis were followed. The result indicated that， as to population diversity index， S. ningpoensis from Wulong： leaf>main stem = branch>root， branch from Chongqing>branch from Wulong. Fifty-eight endophytic fungi were obtained， most of which were the pathogens of the plant. Colletotrichum was the prevailing genus， of which C. gloeosporioides and C. boninense were the prevailing strains. Leaf and seedlings might be the main path of infection. Endophytic fungi and pathogen might convert to each other， influenced by such factors as environment， genotype et al.
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[Key word] Scrophularia ningpoensis； endophytic fungi； identification； phylogenetic analysis
玄參为玄参科玄参属植物玄参Scrophularia ningpoensis的干燥根，始载于《神农本草经》，性微寒，味甘、苦、咸，具有凉血滋阴、泻火解毒的功效，主治热病伤阴诸证，如骨蒸、痨咳、津伤便秘、温毒发斑，及目赤、咽痛、臃肿等[1]。玄参是我国大宗药材品种，市场需求巨大。目前玄参栽培以施用化肥为主，多年连续施用影响药材品质，损害土壤肥力，破坏生态环境。而很多植物内生菌对宿主具有明显的促生作用。内生菌(endophyte) 广泛存在于植物各器官、组织细胞内及细胞间隙，其种类随宿主植物种类、植株器官、地域、季节气候而变化，具有丰富的多样性，国内外相关研究报道很多[2-5]。有研究表明，内生菌及其代谢产物具有拮抗、促生长、抗肿瘤等多种活性，可广泛应用于农业、工业、医药领域[6-9]。玄参内生菌方面的研究极少，仅见文献报道了玄参块根内生菌产哈巴俄苷的相关研究，且未明确鉴定出内生菌的种类[10]。本研究对玄参内生真菌进行了分离和鉴定，并对优势属炭疽菌属内生真菌进行了系统发育分析，旨在为筛选对玄参具有促生长作用的内生真菌，研发微生物肥料，减少化肥施用奠定基础。同时也揭示了玄参内生真菌的分布规律，为进一步研究玄参化学成分与内生菌的相关性，筛选活性物质提供前期基础。
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1 材料
1.1 试验材料采集
2015年8月，在玄参生长盛期，分别采取重庆市中药研究院植物园(以下简称植物园，海拔400 m，北纬29.35°，东经106.33°)人工栽培玄参的侧枝和重庆武隆仙女山杨柳村玄参基地(海拔1 350 m，北纬 29.43°，东经 107.77°)人工栽培玄参全株(叶、主茎、侧枝、根)，采回后立即进行内生真菌分离。
1.2 试剂与仪器
Takara9164和RR178试剂盒购自宝生物公司。DYY-6C水平电泳仪，PTC-100 型 PCR仪，Gel Doc XR凝胶成像仪。
1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200 g，切碎块，煮汁过滤，加葡萄糖20 g，琼脂粉7 g，定容至1 L。
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2 方法
2.1 内生真菌分离与纯化
植物园栽培玄参植株上部、中部、下部健壮无病虫害侧枝各取3～5枝，全部混合后剪3 cm长小段。仙女山玄参植株分解为块根、主茎、侧枝、叶片。块根洗去泥土，轻轻刮去表面薄皮，洗净，切小块；植株主茎上部、中部、下部各取一段(约15～20 cm长)后混合，剪3 cm长小段；植株上部、中部、下部健壮无病虫害侧枝各取3～5枝，全部混合后剪3 cm长小段；植株上部、中部、下部健壮无病虫害叶片各取4～6片后全部混合，剪3～4 cm2小块。以上材料用洗衣粉水洗涤2 min，流水冲洗40 min，75%乙醇洗涤1 min，0.1%升汞消毒5 min，无菌水洗涤4次，取最后一次洗涤的洗液数滴于PDA涂布，共接种3皿，作为对照。材料用无菌滤纸吸干后，再次将根块分为1 cm2小薄片，茎段剪0.5～1 cm长小段，叶片切0.5～1 cm2小片，接种PDA。对照和材料均置于25 ℃培养箱，黑暗，培养5～10 d后，挑取组织周围长出的菌丝转接入 PDA平板中纯化，直到得到纯净无污染的菌落。, 百拇医药(伍晓丽 宋旭红 杨宏国 刘飞 张雪 刘金亮 陈大霞 李隆云)