雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析(3)
2.5 TwMS 的蛋白表达分析
2.5.1 TwMS 表达载体构建 选择重组蛋白表达载体pMALc2X，对载体和基因序列的限制性酶切位点进行分析，选取BamH Ⅰ 和 Pst Ⅰ作为载体构建的连接位点。在雷公藤单萜合酶基因TwMS的ORF两端设计添加限制性酶切位点的引物(表3)，使用NEB Phusion HF PCR Master Mix进行PCR扩增，产物经切胶回收后，将回收得到已添加酶切位点的目的片段与载体分别进行双酶切，反应体系：Cutsmart buffer 5 μL，BamH Ⅰ 1 μL，Pst Ⅰ 1 μL，载体或片段5 μL，ddH2O补足至50 μL。反应条件为37 ℃，1 h。反应结束后将酶切产物进行切胶纯化，回收产物测浓度后按照NEB T4 DNA 连接酶说明书配制反应体系，并于16 ℃，连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌 trans5α克隆感受态细胞中，涂布在含有100 mg·L-1Amp的LB固体培养基上过夜培养 ......
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2.5.1 TwMS 表达载体构建 选择重组蛋白表达载体pMALc2X，对载体和基因序列的限制性酶切位点进行分析，选取BamH Ⅰ 和 Pst Ⅰ作为载体构建的连接位点。在雷公藤单萜合酶基因TwMS的ORF两端设计添加限制性酶切位点的引物(表3)，使用NEB Phusion HF PCR Master Mix进行PCR扩增，产物经切胶回收后，将回收得到已添加酶切位点的目的片段与载体分别进行双酶切，反应体系：Cutsmart buffer 5 μL，BamH Ⅰ 1 μL，Pst Ⅰ 1 μL，载体或片段5 μL，ddH2O补足至50 μL。反应条件为37 ℃，1 h。反应结束后将酶切产物进行切胶纯化，回收产物测浓度后按照NEB T4 DNA 连接酶说明书配制反应体系，并于16 ℃，连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌 trans5α克隆感受态细胞中，涂布在含有100 mg·L-1Amp的LB固体培养基上过夜培养 ......
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