内皮素与肾缺血再灌注损伤
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内皮素(endothelin，ET)是1988年由日本学者Yanagisawa等从猪主动脉内皮细胞培养液中分离纯化出来的一种由21个氨基酸组成的具有强烈缩血管作用的血管活性肽，是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态有重要作用。其中内皮素1(Endothelin1，ET1)是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质[1]。其引起的血管收缩、代谢紊乱和细胞增殖是与血管损伤有关疾病的共同致病因素。本文仅就近年来ET在肾缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injury,IRI)中的作用做一概述。
1 ET的结构、受体和拮抗剂
1.1 ET的结构 ET1分子量为2400D，N端由两个二硫键将115、311位置的半胱氨酸连接起来，C端是一些疏水性氨基酸的残基[1]。N端结构决定其与受体的亲和力，C端结构决定其与受体的结合位置。 ET1另有两个同分异构体即ET2，ET3，他们的结构及功能有很多相似之处，但是不同的ET在基因定位、组织表达、前体原及前体的氨基酸组织及其受体的结合等方面都存在一定的差异。
1.2 ET受体 ET受体(ETR)为细胞表面受体，属G蛋白的偶联受体系列。放射自显影技术表明，体内ET结合位点不仅存在于心血管系统，也广泛存在于脑、肺、肾、肾上腺及小肠等器官。目前应用克隆技术分离出的ET受体有两种类型，即ETAR和ETBR，在血管平滑肌细胞及内皮细胞都有表达。其受体在不同组织中的分布决定了ET作用的多样性：血管平滑肌细胞主要表达ETAR，而内皮细胞只表达ETBR[2]，在人类心肌与冠状动脉中，以ETAR受体为主，刺激血管平滑肌细胞上的ETAR和ETBR导致血管收缩，而内皮细胞的ETBR激活则通过释放一氧化氮(N0)和(或)前列环素(PGI2)导致血管扩张。
1.3 ET作用的分子机制 生理情况下，ET1作用于内皮细胞ETB1R，是一种扩血管物质，在病理情况下，ET1水平增高，与血管平滑肌的ETB2结合，表现其缩血管作用。ET1的缩血管作用还可通过ETAR介导，其缩血管作用机制目前公认与细胞内钙离子浓度持续升高相关。ET与其受体结合后，可通过细胞内不同的信号传递途径，引起不同的生物学效应。主要有：(1)通过与受体相结合的耦联G蛋白，激活磷脂酶C(PLC)分解磷脂酰肌醇，产生1，4，5三磷酸肌醇(IP3)，后者及其代谢产物作用于特殊受体，释放细胞内储存的Ca2+，使胞内Ca2+升高[1]，ET还可激活L型电压依赖性钙离子通道，促进细胞外钙内流，使细胞内游离钙进一步升高，引起血管平滑肌收缩。(2)ET通过G蛋白活化磷脂酶D，产生磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇，进一步转化为二酰肌甘油(DAG)，激活蛋白激酶C(PKC)，催化细胞靶蛋白质磷酸化，产生生物学效应[1]。ET还可以促进靶细胞膜上Na+/H+交换，促进Na+内流H+外流，使胞浆碱化，胞内Na+浓度升高，进一步促进细胞膜上Na+/Ca2+交换，使胞外Ca2+内流，引起血管平滑肌收缩。(3)ET与受体结合后，通过依赖于精氨酸途径的EDRF/NO合成，激活可溶性鸟苷酸环化酶，增加cGMP含量，产生生物学效应[3]。(4)ET通过G蛋白活化磷脂酶A2(PLA2)，产生花生四烯酸代谢产物PGE2等，通过花生四烯酸代谢途径发挥作用[4]。
2 ET及ETR在肾脏中的分布
2.1 ET在肾脏中的分布 肾脏既是ET合成代谢的重要场所，又是ET生物学效应的重要靶器官。肾脏对ET的敏感性比其他器官大10倍。ET在肾脏内的分布呈不均一性，分布特征与其肾效应密切相关。 Wilkes等[5]利用免疫过氧化物酶技术发现，ET在大鼠肾皮质、髓质及乳头区广泛分布。尚有报道，ET1 mRNA存在于肾单位各段，但是以内髓集合管最为丰富。Terada等[6]用RTPCR技术观察到，ETl与ET3在大鼠肾脏的分布明显不同，前者的mRNA较多在肾小球及内髓集合管表达，而后者主要沿肾单位分布，在近曲小管、直小管、皮质集合管、外髓集合管、直管束以及肾小球和内髓集合管均有大量的表达。Kohan等[7]利用放免法观察离体培养的兔肾小管ET1与ET3的产生。ET1产生的量依次为内髓集合管>髓袢降支粗段>皮质集合管>近曲小管，而ET3则为内髓集合管>髓袢降支粗段>近曲小管>皮质集合管，表明肾髓质ET含量明显高于皮质，而内髓ET的含量又明显高于外髓。ET1与ET3在肾脏分布的差异性以及对肾缺血的不同反应，提示ET1和ET3可能以不同方式调节肾脏功能。
2.2 ETR在肾脏中的分布 肾脏内有广泛的ETR分布，ETR在肾内亦呈不均一分布，主要聚集在肾小球、内髓和肾小管。其亚型主要为ETAR及ETBR。ETAR主要位于肾小球及肾脏系统，可能参与肾脏循环和内分泌功能的调节。ETBR则位于肾小球、内髓和外髓集合管的上皮细胞。Chow等[8]用RTPCR技术研究发现，ETBR mRNA存在于内外髓集合管的上皮细胞，ETAR则主要在内外髓的间质细胞及直小血管的外周细胞。Terada等[9]也发现，大量的ETBR位于内髓集合管始末端及肾小球，而皮质集合管和外髓集合管、直小血管束、弓状动脉只有少量的ETBR，ETAR则仅存在于肾小球、直小血管及弓状动脉。ETAR和ETBR位点分别有着各自不同的来源，ETAR存在于间叶细胞来源的肾小球系膜细胞、血管平滑肌细胞和肾髓质间质细胞，而ETBR则存在于上皮细胞来源的外髓集合管和内髓集合管[5]。ETR位点分布的不同，可能与其在肾脏各部位的生理作用有密切的关联。
3 ET及其生物效应拮抗剂与肾缺血再灌注损伤
3.1 ET与肾缺血再灌注损伤 肾脏为高灌注器官，对缺血以及缺血再灌注均敏感。IRI是缺血性急性肾功能衰竭(ischemic acute renal failure，IARF)的重要损伤环节，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的主要因素。ET在肾脏功能的调控和肾脏疾病的发生发展中具有非常重要的作用，流行病学调查显示ET1水平升高与早期肾功能障碍有关系[10]。分子生物学实验也证明肾脏原位产生的ET是IRI肾组织中ET的主要来源[11]，不同类型ET mRNA表达针对不同的调节，在缺血性肾衰中主要是ET1通过自分泌和旁分泌方式发挥作用。IRI增加肾脏ET的合成和释放，并提高ET1与ETAR的亲和力，使肾内ET的作用占主导地位，导致入球小动脉、出球小动脉和间质细胞的收缩及细胞内钙超载等改变，造成肾损伤。
3.2 ET在肾缺血再灌注损伤中的作用 组织缺血缺氧可使血管内皮细胞受损，ET产生和释放增多，ET可进一步使肾血管收缩，加重肾组织缺血缺氧。研究表明，ET可以增加细胞内钙离子的释放和细胞外钙内流，使胞内钙离子浓度增高，进而发挥其生物学作用。Firth等[11]发现，ET1及ET3 mRNA在大鼠肾脏均有表达，但在肾缺血缺氧45 min再灌注6 h后，ET1 mRNA表达增加4倍，而ET3 mRNA表达却下降了19%。通过缺血和再灌注不同时相点血浆和不同层，肾组织中ET1含量的测定发现：再灌注1 h后，血浆及组织中ET1含量均有明显升高，以再灌注6 h最明显，不同层肾组织再灌注后ET1水平变化不一致，髓质的改变较为持久。用放射免疫方法(RIA)检测大鼠左肾动脉夹闭60 min致ARRI模型其血浆和肾组织ET水平变化，结果也显示缺血和再灌注损伤后大鼠肾皮质、髓质ET水平均较正常明显升高，以再灌注3 h最为显著；此外，在大鼠双侧肾动脉夹闭45 min后所致的急性肾衰模型中也发现：血浆和肾组织ET水平均明显升高，这主要归因于缺血再灌注时内皮细胞的损伤，也是急性肾衰早期的主要因素，而再灌注后20 h血浆ET水平未见增长，认为可能是从肾脏释放出的ET被全身血液系统稀释[12]。
3.3 ET受体与肾缺血再灌注损伤 缺血性肾衰时，血浆内皮素水平明显升高，ET受体上调。吴雄飞等[13]发现，再灌注后肾脏ETAR，ETBR两种受体亚型mRNA水平均明显增强，ETAR mRNA以皮质增强明显，与髓质差异显著，表达高峰与ET1 mRNA一致。而再灌注后，ETBR mRNA主要是近曲小管、远曲小管及集合管上皮细胞胞浆及内缘增强，髓质较皮质ETB mRNA升高更为明显。原位杂交显示两种受体亚型在缺血后增强定位不同，ETAR mRMA主要位于小动脉，ETBR mRNA主要位于肾小管，说明缺血再灌注肾脏内皮素受体亚型上调在皮质以ETA为主，与增多的ET1结合主要导致肾皮质血管显著收缩；在髓质以ETB上调为主，与增多的ET1或ET3结合，主要影响髓质的肾小管集合管水钠代谢。Nambi等[14]在大鼠急性肾缺血模型中发现：ET与其受体亲和力随缺血再灌注时相的延长而增加，且肾功能的损伤与肾缺血后ET受体亲和力增加直接相关。缺血时，局部ETR浓度升高，主要是由于它的合成增加，或者降解减少抑或二者兼而有之。在对ETBR缺乏的纯合子大鼠的研究中也证实：ETBR在急性缺血性肾衰发展中不占主导地位，但是在对肾衰恢复的进程中提供有益的保护[15]。
4 ET生物效应拮抗剂与肾缺血再灌注损伤
4.1 ET生物效应拮抗剂 目前已知的ET拮抗剂有肽类和非肽类两种，根据其对ET拮抗机制可分为ETR拮抗剂和其它类，其中ETR拮抗剂依据其与ETAR和ETBR亲和力的不同，分为：(1)选择性ETAR拮抗剂，包括BQ123和TA0201等；(2)选择性ETBR拮抗剂，包括BQ788和RES7011等；(3)非选择性(混合性)ETR拮抗剂，包括Bosentan等，它们既能阻断ETAR，又能阻断ETBR。除ETR拮抗剂外，ET生物效应拮抗剂还有：钙离子拮抗剂，如硝苯吡啶(二氢吡啶类)和心钠素等；抗氧化剂，如α硫辛酸等；一氧化氮前体及供体，如精氨酸和硝普钠等。
4.2 ET生物效应拮抗剂与肾缺血再灌注损伤 用ET的生物效应拮抗剂竞争性地与受体结合或者阻断ET生物效应的某个环节，可抑制ET的生物学效应。ETAb可通过中和体内过多的ET，起到拮抗和阻断ET的生物学效应，改善肾内血流动力学，减轻肾损伤。已经证实选择性ETAR拮抗剂VML588可部分拮抗ET1所致的肾功能障碍[16]，选择性ETBR拮抗剂可拮抗ET1引起的潜在缩血管效应。Maeda[17]证实：在肾缺血前给予选择性ETAR拮抗剂或非选择性ETAR和ETBR拮抗剂，均可延缓肾小球滤过率(GFR)的降低，BQ123和Bosentan能竞争性地分别与ETAR及ETAR、ETBR结合，阻止ET1对肾脏的直接作用，改变IARF的进程，因此在急性肾缺血前及再灌注的早期使用BO123和Bosentan，可阻止胞外钙大量内流和钙池动员，改善肾灌流状态[18]，从而改善缺血再灌注损伤。而Forbos等[19]近期发现：在肾缺血再灌注模型中，同时阻断ETAR和ETBR可造成长期肾功能障碍，而选择性阻断ETAR却有利于肾功能恢复。钙离子拮抗剂硝苯吡啶(二氢吡啶类)可以抑制L型电压依赖性钙通道，阻止钙内流，从而拮抗ET的血管收缩和钠水潴留效应。由于ET和N0失调在肾缺血再灌注损伤中有重要意义[16]，利用L精氨酸或在肾缺血再灌注早期给予一氧化氮供体硝普钠可对抗ET合成释放增多及降低ET1的表达，起到减轻肾功能损伤的作用[19]。心钠素也可通过减轻胞内钙超载而实现其拮抗ET的缩血管作用，提前给予缺血性急性肾衰大鼠α硫辛酸可以保护肾功能和防止组织损伤，其可能的机制是抑制缺血后肾内ET1的过度生成[21]。最近报道[22]，八种左旋氨基酸的混合液也可以减轻肾脏ET1释放紊乱。综上所述，ET及其受体在肾缺血再灌注损伤发病机制中占有重要地位，有效的ET生物学效应拮抗剂的发现和研究将为肾缺血再灌注损伤和急性肾功能衰竭的防治开辟一条崭新的途径。
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作者单位： 046000 山西省长治医学院生理教研室(河北医科大学03级在读研究生)(刘燕)；河北省医学科学院(夏晓红)
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