姚卫 黄伟 张斌

    心血管疾病是一种严重威胁人类尤其是中老年人群健康的常见疾病。动脉粥样硬化是一个慢性炎症过程，也是心血管疾病致死的主要原因之一，其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖、迁移等是动脉粥样硬化的关键环节[1,2]。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)可介导VSMCs细胞的活化、增殖、迁移等，抑制AngⅡ诱导的VSMCs细胞增殖和迁移对防治心血管疾病具有重要意义[3]。茯苓是中国的一种传统中药材，多用于风湿性关节炎、皮肤病等疾病的治疗。杨鹏飞[4]研究显示，桂枝茯苓胶囊可抑制血清诱导的血管平滑肌细胞增殖。目前，茯苓提取物对AngⅡ诱导的VSMCs细胞生物学行为的影响还未知。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子非编码单链RNA，参与调控细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学行为，与疾病的发生发展密切相关[5]。研究显示，miR-649在去血清处理的血管平滑肌细胞中表达增加[6]，提示miR-649可能参与调控VSMCs细胞的生物学行为。本研究通过AngⅡ诱导的VSMCs细胞，探讨茯苓提取物对VSMCs细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制，以期为动脉粥样硬化治疗药物的研发提供一定的新方向。

    1 材料与方法

    1.1 细胞与实验试剂 人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMCs)购自美国ScienCell公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、DMEM高糖培养基和BCA蛋白测定试剂盒购自北京索莱宝公司；胰蛋白酶和四甲基噻唑蓝(methylthiazoletrazolium，MTT)购自美国Sigma公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自美国Fermentas公司；LipofectamineTM 2000试剂盒和Trizol试剂，美国Invitrogen公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成；miR-649模拟物(mimics)及模拟阴性对照物、抑制剂及阴性对照序列、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1，Aktl)野生型质粒(WT-Aktl)和突变型质粒(MUT-Aktl)，由上海吉凯基因公司合成；兔抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21多克隆抗体购自多Anbo生物科技有限公司；上皮性钙粘附蛋白(Epithelial cadherin，E-cadherin)抗体购自武汉维克赛思科技有限公司；基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2 ......