鸡胚地龙膏对急性软组织损伤模型组织病理学及细胞因子的影响(2)
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【Key words】 Jipei Ointment；Acute soft tissue injury； Histopathology；plasma viscosity；IL-1β level
急性软组织损伤是骨伤科临床常见病、多发病。临床主要表现为局部肿胀、疼痛、功能障碍、青紫瘀斑等。我院研制的鸡胚地龙膏是具有明显的抗炎及活血化瘀、消肿止痛功效的外用膏剂[1]。本实验以新西兰大白兔制作急性软组织损伤实验模型,探讨鸡胚地龙膏对模型组织病理学、血浆黏度及细胞因子的影响。现报道如下。
材料与方法
1.药物 ①鸡胚地龙膏：由锡生藤、骨碎补、五加皮等15味中药组成。规格: 7.5 cm×7.5 cm，由贵州省黔南州中医医院制剂室提供。②奇正消痛膏:主要由独一味、棘豆、姜黄、水柏枝等组成,由奇正藏药集团提供，国药准字Z54020113。
2.造模及分组 105只新西兰大白兔(由贵阳医学院动物实验中心提供),成年雄性,体重(2.5±0.39)kg,月龄3个半月。所有兔子给予饲料喂养(饲料由东方希望集团生产),自由饮水。适应性饲养(室温19～24℃,相对湿度40%左右)5天后,随机选出21只为正常对照组，剩余84只新西兰大白兔制作左后腿部急性软组织损伤模型[2],造模成功后随机分为4组,模型对照组、阳性药物组(奇正消痛膏组),鸡胚低剂量组和鸡胚高剂量组,每组21只动物。模型对照组不作处理，自然恢复, 阳性药物组采用奇正消痛膏治疗(1 g/kg)，鸡胚低剂量组和鸡胚高剂量组采用鸡胚地龙膏治疗，药物剂量分别为0.15 g/kg和0.75 g/kg。阳性药物组、鸡胚低剂量组和鸡胚高剂量组药膏涂布面积以超过受损区面积1/2以上为度,外用特制胶布及卫生胶布固定、包扎，每天换药1次,共给药8天。五组兔子在实验期间均无死亡。
3.血浆黏度检测 造模后即刻及分别在第1、2、3、6、8 天各组随机选取新西兰大白兔3只,采集血液标本作血浆黏度检查。抽血时间在清晨8∶00兔进食前，抽血部位为兔耳中动脉，每只动物采血3 ml。 血液注入肝素抗凝离心管。以3000 r/min离心15 min。采用R28A型血液黏度测试仪进行测试，采用国际准/板式测量方法，离心后取出上层血浆0.8 ml注入测试仪内,测试时间10 s,取切复率为200%,黏度单位为mPa•s-1。
4.组织形态学检查及组织液制备 每组动物采血完成后，分别对各组动物进行软组织损伤外表观察和组织学观察评分[2],评分完毕快速处死,取打击中心部位皮肤和肌肉组织用10%甲醛固定,石蜡包埋切片, HE染色, 光镜观察创伤局部皮下组织、肌肉组织和创伤性无菌性炎症反应等病理表现。另外用手术刀切开兔受打击部位皮肤,分离皮下组织,切取受打击部位中心呈青紫色的肌肉组织,用生理盐水漂洗1 min,滤纸吸干，分析天平称取(200±5)mg,每10 mg组织加入生理盐水0.5 ml,于匀浆器中缓慢而均匀地研磨15 min,至匀浆液呈均匀一致悬浊液,倒入试管中在高速冷冻离心机以2500 r/min离心15 min,收集上清液,置于-20℃冰箱中备用。
5.IL-1β检测 采用ELISA方法测定,按说明书操作(试剂由上海信然实业有限公司提供,进口分装)。
6.统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(-±s)表示，采用两样本均数t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
结 果
1.软组织病理学评分 新西兰大白兔左后腿部软组织打击伤后,肉眼即见损伤部位迅速出现皮下出(瘀)血和肿胀,且伤势呈持续性加重, 以伤后24 h最明显,随后逐日减轻。鸡胚高剂量组与模型组比较,伤肢肿胀程度低,消退速度快,在伤后第3天已见明显消退。而模型组至第8天左后腿局部仍残留皮肤瘀斑，多数模型兔局部出血、瘀血和水肿面积仍大于1 cm2。各组软组织病理学评分比较，伤后鸡胚高剂量组的软组织病理学评分值有逐步下降趋势，并且低于模型对照组、阳性药物组及鸡胚低剂量组(P<0.05或0.01)。见表1。
2.血浆黏度的检测结果 伤后鸡胚高剂量组的血浆黏度检测值有逐步下降趋势，并且低于模型对照组、阳性药物组及鸡胚低剂量组(P<0.05或0.01)。见表2。
3.组织形态学检查结果
(1)模型对照组病理动态变化：创伤后第1天,皮下组织水肿加重,创伤病灶中嗜中性粒细胞浸润密度增高,可见真皮和皮下组织水肿,嗜中性粒细胞炎症细胞浸润；伤后第2天,局部皮下组织水肿仍比较明显,创伤病灶中嗜中性粒细胞浸润密度高；伤后第3天局部皮下组织水肿减轻,创伤病灶中嗜中性粒细胞浸润密度降低,可见皮下出血和血肿部分吸收,残留血肿周围纤维组织增生并有许多纤维母细胞长入血肿；伤后第6天, 血肿基本吸收或机化，皮下小血管增多并有明显的扩张充血现象；伤后第8天可见再生的横纹肌纤维。
(2)鸡胚高剂量组病理动态变化：创伤后1天,皮下见出血、水肿加重，肌内出血较多，肌横纹模糊，皮肤表层及皮下见中性粒细胞浸润(见封四图1)；伤后第2天，皮下及肌内见灶性出血，与第1天相比无明显变化，但皮肤表皮及皮下炎性细胞浸润明显减少，感染得到控制(见封四图2)；伤后第3天皮肤表面及皮下见炎性细胞浸润及出血，皮下组织水肿得到有效控制，并见纤维母细胞及毛细血管增生(见封四图3)；伤后第6天皮下见纤维母细胞及毛细血管明显增生，肌纤维母细胞明显增生，皮下及肌内未见出血，见散在少许炎细胞浸润(见封四图4)；伤后第8天肌纤维母细胞明显增生(见封四图5)。
4.血浆及组织液中IL-1β的水平 鸡胚高剂量组血浆及组织液中IL-1β水平分别与正常对照组、模型对照组、阳性药物组及鸡胚低剂量组比较差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)，四组造模组中，鸡胚高剂量组伤后3、6、8天血浆及组织液中IL-1β的水平最低(P<0.05或0.01)。见表3。
讨 论
急性软组织损伤属于中医“筋伤”范畴,是指外力作用致皮肤、皮下组织、筋膜、肌肉、肌腱、韧带、滑膜、关节囊等软组织及一部分软骨和周围神经、血管的损伤,是骨伤科中最常见的疾患。中医认为急性软组织损伤的本质是血瘀,损伤之后脉络破损,血离经而成瘀,瘀而化热。《普济方•折伤门》云:“若因伤折内动经络,血行之道不得宣通。瘀积不散,为肿为痛。”故治疗以活血化瘀、清热凉血为主。鸡胚地龙膏属药物透皮给药体系,药物能在创伤局部维持相对稳定的血药浓度,在局部起到止痛、散瘀消肿作用，主要由锡生藤、骨碎补、丁公藤、茜草、地龙、大血藤、牡丹皮、马齿苋和五加皮等15味中药组成。该方以活血化瘀消肿止痛为治则,用温药锡生藤祛风通络、活血散瘀，辅以丁公藤活血止血散瘀止痛,大血藤理气活血;佐以虎杖,解毒除湿,行瘀导泻,渗透利水化瘀而通经络；使以附子通行经络,妙用出壳之小鸡血肉有情之品,益气补精生肌,引药入骨肉血脉为使药。诸药合用可使腠理疏通,气血流畅,活血消肿。现代药理研究证实,茜草具有止血、活血功能，清除自由基的作用[3];马齿苋、丁公藤、大血藤具有消炎、镇痛作用,具有抑菌、抗炎及免疫调节作用,对多种病菌有抑制作用,还具有抗炎活性,同时可以降低毛细血管通透性,减少渗出[4~6] ......
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